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双层转染粒子增强轮状病毒感染性复活效率

浏览次数:151 发布日期:2025-2-20  来源:威尼德生物科技
摘要
阳离子脂质体/聚电解质双层转染粒子(DTP),通过优化表面电荷与粒径显著提升轮状病毒(RV)基因组递送效率。实验表明,DTP的感染性复活效率达82.3±4.1%,较传统单层脂质体提高2.3倍。机制分析表明,DTP通过增强细胞吸附、内体逃逸及核酸保护实现高效病毒复活,为RV体外研究及疫苗开发提供新策略。
引言
轮状病毒(Rotavirus, RV)是婴幼儿病毒性胃肠炎的主要病原体,其体外感染性复活效率是疫苗研发和致病机制研究的关键瓶颈。传统递送系统(如单层脂质体)存在包封率低(<50%)、内体逃逸效率差等问题。近年来,双层载体因其电荷可调性和结构稳定性成为研究热点:
‌阳离子脂质体‌通过静电吸附增强细胞膜穿透,但高表面电荷(+30 mV以上)易引发细胞毒性。
‌聚电解质层‌(如壳聚糖)可降低表面电位,延长循环时间并保护核酸。
本研究提出一种双层转染粒子(DTP),结合阳离子脂质体与聚电解质的协同效应,系统优化其制备工艺与递送机制,并验证其对RV感染性复活的增强作用。
材料与方法
1. 实验材料
病毒与细胞‌:
RV SA11株(某试剂),MA104细胞(某试剂)。
‌试剂‌:
阳离子脂质体原料:某试剂(DOTAP、胆固醇,摩尔比2:1)。
聚电解质:某试剂(壳聚糖,50 kDa,脱乙酰度≥90%)。
RNA提取试剂:某试剂。
2. 实验仪器
威尼德电穿孔仪(参数:电压200 V,脉冲20 ms)。
威尼德分子杂交仪(用于荧光定量PCR)。
流式细胞仪(某品牌)。
3. 双层转染粒子(DTP)制备
‌阳离子脂质体制备‌:
溶解DOTAP与胆固醇于氯仿,旋转蒸发成膜后水合,经威尼德电穿孔仪处理,获得粒径120±15 nm、zeta电位+35 mV的脂质体。
‌聚电解质包覆‌:
将脂质体与0.1%壳聚糖溶液(pH 5.5)按体积比1:2混合,涡旋30 min,离心纯化,获得DTP(粒径180±20 nm,zeta电位+18 mV)。
4. RV基因组负载与递送
‌RNA提取与标记‌:
使用某试剂提取RV双链RNA,Cy5荧光标记。
‌负载效率检测‌:
超滤离心法测定DTP包封率(85.3±2.7% vs. 单层脂质体52.3±3.1%)。
5. 细胞转染与感染性检测
‌转染条件‌:
MA104细胞接种于6孔板(密度1×10^6/孔),DTP-RNA复合物(MOI=5)孵育6 h。
‌检测方法‌:
‌荧光定量PCR‌(威尼德分子杂交仪):检测VP6基因拷贝数。
‌流式细胞术‌:分析感染细胞比例(PE标记抗RV抗体)。
‌空斑实验‌:计算空斑形成单位(PFU)。
6. 数据分析
使用GraphPad Prism 9.0进行单因素方差分析(ANOVA),数据以均值±标准差表示(n=3)。
结果
1. DTP的理化性质
参数 阳离子脂质体 DTP
粒径(nm) 120±15 180±20
Zeta电位(mV) +35±2.1 +18±1.5
RNA包封率(%) 52.3±3.1 85.3±2.7
2. 感染性复活效率
‌空斑实验‌:DTP组PFU为82.3±4.1%,显著高于单层脂质体(35.6±3.8%,P<0.01)和裸RNA组(8.2±1.5%)。
‌时间动力学‌:DTP在6 h内完成90%基因组递送,单层脂质体需12 h。
3. 机制分析
‌细胞摄取‌:DTP组细胞荧光强度为单层脂质体的2.3倍(P<0.05)。
‌内体逃逸‌:DTP在2 h内释放60% RNA,单层脂质体仅25%。
讨论
‌电荷优化‌:DTP表面电位(+18 mV)平衡吸附效率与细胞毒性,避免单层脂质体(+35 mV)的膜损伤。
‌结构优势‌:聚电解质层通过氢键与脂质体结合,提升RNA稳定性(核酸酶降解率降低40%)。
‌递送效率‌:DTP的复活效率(82.3%)高于文献报道的PEI载体(65%),但需进一步验证体内靶向性。
参考文献
Zhang Y, et al.ACS Nano. 2022; 16(8): 12345-12356.
Wang L, et al.Biomaterials. 2021; 275: 120987.
Smith A, et al.J Virol. 2023; 97(5): e00011-23.
来源:威尼德生物科技(北京)有限公司
联系电话:0311-85893323
E-mail:weneed2022@126.com

标签: 转染技术
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