采用纳米流式细胞术对血浆细胞外囊泡测试样品的标准化测量

“细胞外囊泡”(EVs)是细胞自然释放的细胞衍生颗粒与磷脂双分子层。EVs存在于体液中，如血液和尿液。EVs的特性，如细胞起源、浓度、组成和功能是疾病依赖性的。因此，人们正在探索EVs作为疾病的生物标志物，包括癌症和心血管疾病。然而，为了将EVs作为生物标志物，需要可靠和可重复的EVs测量方法。目前，EVs生物标志物研究的主要障碍是仪器和不同单位之间测量结果的不可比性，这阻碍了多中心研究的建立。多中心研究是临床生物标志物研究的先决条件。

为了提高数据的可比性，本研究开发具了有类似EVs物理性质的新参考材料和参考程序。新参考材料和参考程序的验证需要生物测试样品。我们开发了一种人血浆EVs测试样品(PEVTES)，它i)类似于血浆中的亚细胞颗粒，ii)是现成的，iii)与流式细胞仪兼容，iv)是稳定的。方法:采用3例空腹供体血浆制备PEVTES。用血小板特异性(CD61)和红细胞特异性(CD235a)抗原或乳黏附素抗体对EVs进行免疫荧光染色。为了降低可溶性蛋白、脂蛋白和未结合试剂的浓度，通过大小排斥层析从血浆中分离染色的EVs。分离后，过滤PEVTES以去除残余血小板。PEVTESs用冷冻保存剂、二甲亚砜（DMSO）、甘油或海藻糖稀释，在- 80℃保存12个月。解冻后，用校准的纳米流式细胞仪(Apogee A60-Micro)测量染色的EV浓度。

为了评估PEVTES稳定性，在冷冻前和- 80◦c条件下保存1、3、6和12个月后，用流式细胞仪测量染色的EVs浓度，并对其流速、荧光信号和光散射信号进行校准。制备PEVTES的不同步骤的示意图概述。步骤包括人血浆的收集和制备，染色程序，尺寸排除层析，用0.8 μm 孔径大小的聚碳酸酯过滤器去除残留的血小板，并通过添加不同的冷冻保存保存PEVTES（图1）。

图1.制备血浆细胞外囊泡(EV)检测样品(PEVTES)的实验流程。

用校正纳米流式细胞仪(Apogee A60-Micro, Apogee flow Systems)测量(A)染色的人血浆和(B)储存在(B)二甲亚砜(DMSO)、(C)甘油或(D)海藻糖中的冻融血浆EV测试样品(PEVTES)的等效可溶性荧光色素(MESF)的直径(nm)与荧光强度(异体藻蓝蛋白(APC)分子)。红色门表示免疫荧光染色(血小板来源)的EVs群体，可以根据散射信号从背景中区分出来(图2)。

图2. 流式细胞仪测量冻融血浆EV测试样品(PEVTES)

与不涉及冻融循环的新鲜起始材料相比，在DMSO中保存12个月的CD61+ EVs的测量浓度下降了33%，在甘油中保存增加了9%，在海藻油中保存增加了6%，图3A-C。为CD235a+ EVs的浓度图3D-F所示的CD235a+ EV在DMSO、甘油和海藻糖中的浓度分别比新鲜起始材料降低约70%、23%和15%。图3G-I所示，乳酸粘附素+EV的浓度在DMSO中分别下降23%，甘油中下降28%，海藻糖中下降19%(图3)。

图3. 血浆EV测试样品(PEVTES)贮存期间的稳定性检测

 
结论

PEVTES 1)类似于血浆中的亚细胞颗粒，2)易于使用，3)与纳米流式细胞术兼容，4)稳定性好。因此，开发的PEVTES是验证新开发的参考物和程序的理想候选物。

原文：Plasma extracellular vesicle test sample to standardize flowcytometry measurements

英国Apogee超灵敏纳米流式分析仪，专为外泌体微囊泡（EVs）等小颗粒分析优化设计，在EVs样品颗粒大小分析，绝对定量，多标记物同时快速分析工作中广泛应用。截止目前，该设备已累计参与数百篇高质量同行审议文章相关实验分析工作。其出色的灵敏度，稳定性及可靠性已备受业内广泛认可，并将继续为EVs相关基础研究及转化应用提供坚实支持。

Apogee纳米流式除了可用于纳米级别的颗粒 （如：细胞外囊泡、外泌体、微生物、病毒颗粒、LNP） 等，还可以用于作常规动物细胞检测 （如免疫细胞、哺乳类动物细胞、等）。它是一台全面且功能强大的纳米流式分析仪！

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