使用G418筛选HEK-293T细胞的详细步骤
使用G418筛选HEK-293T细胞的详细步骤
1. 细胞培养：复苏HEK-293T细胞，用合适的培养基（如DMEM高糖培养基，含 10%胎牛血清等）在37℃、5% CO₂培养箱中培养，待细胞汇合度达80%-90% 时进行传代或转染操作。
2. 确定G418筛选浓度：如客户所做，在96孔板中接种细胞，设置 0 - 1100 μg/mL的G418浓度梯度，用CCK8 检测培养24小时的细胞活性，绘制细胞活力图，确定HEK-293T细胞的G418 最小致死量。
3. 转染：将目的基因连接到pCDNA3.1载体上，使用合适的转染试剂（如Lipofectamine 3000 ），按照试剂说明书将重组载体转染到HEK-293T细胞中，转染6小时后换液。
4. 加药筛选：转染后1 - 2天，根据确定的最小致死量，加入适量G418进行筛选。可以先采用较低浓度筛选一轮，比如最小致死量的 1/2 - 2/3浓度，维持筛选2 - 3周，期间每2 - 3天换液并补充G418 。然后再用较高浓度（接近或等于最小致死量）进行第二轮筛选1 - 2周。
5. 单克隆挑选：待细胞形成单克隆后，用有限稀释法或细胞克隆环将单克隆细胞挑选到96孔板中继续培养，扩大培养后检测目的基因的表达情况。
HEK-293T细胞筛选注意事项
1. 细胞状态：确保用于转染和筛选的HEK-293T细胞处于良好的生长状态，细胞活力应在90% 以上，且无支原体等污染。
2. 转染效率：优化转染条件，包括转染试剂与DNA的比例、转染时间等，以提高转染效率。可设置不同转染条件的对照组，确定最佳转染方案。
3. G418质量：G418的质量对筛选结果影响较大，应选择质量可靠的产品，使用前检查其效价和纯度，溶解后过滤除菌，-20 ℃保存。
4. 筛选浓度：筛选浓度需根据细胞活力图结果和实验经验确定，浓度过低可能导致假阳性细胞过多，过高则可能杀死阳性细胞。
5. 换液频率：筛选期间换液频率不宜过高或过低，过高可能导致细胞生长受影响，过低可能使代谢废物积累影响细胞状态和筛选效果。
6. 无菌操作：整个筛选过程需严格遵守无菌操作规范，防止杂菌污染。
文献资料:
• 《分子克隆实验指南（第四版）》
• 《细胞生物学实验技术教程》
• Kaufman R J. Large-scale mammalian cell culture[J]. Current opinion in biotechnology, 1990, 1(2): 175-180.
1. 细胞培养：复苏HEK-293T细胞，用合适的培养基（如DMEM高糖培养基，含 10%胎牛血清等）在37℃、5% CO₂培养箱中培养，待细胞汇合度达80%-90% 时进行传代或转染操作。
2. 确定G418筛选浓度：如客户所做，在96孔板中接种细胞，设置 0 - 1100 μg/mL的G418浓度梯度，用CCK8 检测培养24小时的细胞活性，绘制细胞活力图，确定HEK-293T细胞的G418 最小致死量。
3. 转染：将目的基因连接到pCDNA3.1载体上，使用合适的转染试剂（如Lipofectamine 3000 ），按照试剂说明书将重组载体转染到HEK-293T细胞中，转染6小时后换液。
4. 加药筛选：转染后1 - 2天，根据确定的最小致死量，加入适量G418进行筛选。可以先采用较低浓度筛选一轮，比如最小致死量的 1/2 - 2/3浓度，维持筛选2 - 3周，期间每2 - 3天换液并补充G418 。然后再用较高浓度（接近或等于最小致死量）进行第二轮筛选1 - 2周。
5. 单克隆挑选：待细胞形成单克隆后，用有限稀释法或细胞克隆环将单克隆细胞挑选到96孔板中继续培养，扩大培养后检测目的基因的表达情况。
HEK-293T细胞筛选注意事项
1. 细胞状态：确保用于转染和筛选的HEK-293T细胞处于良好的生长状态，细胞活力应在90% 以上，且无支原体等污染。
2. 转染效率：优化转染条件，包括转染试剂与DNA的比例、转染时间等，以提高转染效率。可设置不同转染条件的对照组，确定最佳转染方案。
3. G418质量：G418的质量对筛选结果影响较大，应选择质量可靠的产品，使用前检查其效价和纯度，溶解后过滤除菌，-20 ℃保存。
4. 筛选浓度：筛选浓度需根据细胞活力图结果和实验经验确定，浓度过低可能导致假阳性细胞过多，过高则可能杀死阳性细胞。
5. 换液频率：筛选期间换液频率不宜过高或过低，过高可能导致细胞生长受影响，过低可能使代谢废物积累影响细胞状态和筛选效果。
6. 无菌操作：整个筛选过程需严格遵守无菌操作规范，防止杂菌污染。
文献资料:
• 《分子克隆实验指南（第四版）》
• 《细胞生物学实验技术教程》
• Kaufman R J. Large-scale mammalian cell culture[J]. Current opinion in biotechnology, 1990, 1(2): 175-180.
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HEK-293T细胞
