磷酸钙盐沉淀法构建双质粒稳转细胞系

摘要

本文旨在探讨利用磷酸钙盐沉淀法构建表达血管紧张素II受体1型（AT1）和钙/钙调蛋白依赖性激酶II（CaMKII）的双质粒稳转细胞系的可行性，并分析其在基因功能研究中的应用价值。实验结果显示，磷酸钙盐沉淀法能有效实现双质粒共转染，为基因表达与功能研究提供了可靠的平台。

引言

在分子生物学和基因工程领域，质粒转染是一种重要的实验技术，能够将外源DNA引入宿主细胞，从而表达特定的基因或进行基因敲除实验。质粒转染技术在基因功能研究、药物筛选、基因治疗等领域具有广泛的应用价值。构建稳转细胞系是实现长期稳定表达外源基因的关键步骤，对于深入探究基因功能具有重要意义。

磷酸钙盐沉淀法是一种经典的质粒转染方法，具有成本低廉、操作简便的优点，适用于大多数类型的细胞。然而，传统的磷酸钙盐沉淀法主要用于瞬时转染，对于构建稳转细胞系的研究相对较少。本文旨在探讨利用磷酸钙盐沉淀法构建双质粒稳转细胞系的可行性，并分析其在基因功能研究中的应用价值。

材料与方法
1. 材料

• 细胞株：COS7细胞
• 质粒：带HA-tag的AT1质粒（WT，小鼠来源）；带V5-tag的CaMKII质粒（δB/WT，小鼠来源）
• 试剂：某试剂（包括CaCl₂、PBS、2×HBS缓冲液、G418等）
• 仪器：琼脂糖凝胶电泳仪、聚丙烯酰胺凝胶电泳及半干法电转仪、荧光显微镜等

2. 方法
2.1 质粒制备与鉴定

1. 质粒扩增与抽提：将AT1和CaMKII质粒分别转化至大肠杆菌JM109中，扩增后使用Qiagen质粒抽提试剂盒进行质粒抽提。
2. 质粒鉴定：通过双酶切法及琼脂糖电泳鉴定目的DNA片段，确保质粒浓度与纯度符合要求，无蛋白和RNA污染。

2.2 细胞培养与铺板

1. 细胞培养：使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5% CO2条件下培养COS7细胞。
2. 细胞铺板：待细胞生长至对数期，用胰酶消化后接种至6孔培养板，每孔接种2×10^5个细胞，待细胞贴壁后开始转染。

2.3 磷酸钙盐沉淀法制备与转染

1. 转染前准备：更换新鲜培养基，确保细胞密度约为80%。
2. 制备磷酸钙-DNA沉淀：将质粒DNA（AT1和CaMKII）与CaCl₂混合，再加入2×HBS缓冲溶液，静置20分钟后形成磷酸钙-DNA沉淀。
3. 细胞转染：将磷酸钙-DNA沉淀加入细胞培养基中，轻轻摇匀后置于37℃、5% CO2培养箱中孵育。
4. 孵育与筛选：孵育8-24小时后，更换新鲜培养基，继续培养24小时。然后使用G418进行抗性筛选，每3-4天更换一次选择培养基，直至出现抗药性的细胞克隆。

2.4 检测与鉴定

1. 免疫荧光法（IF）：使用荧光显微镜观察细胞表面表达的AT1（及其所带的HA-tag）和细胞质内表达的CaMKII（及其所带的V5-tag）。
2. 免疫印迹法（WB）：提取细胞蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转膜后使用特异性抗体进行Western blot检测，验证目的蛋白的表达。
3. 功能检测：给予转染细胞血管紧张素II（AngII）刺激，使用Western blot检测磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERK）的改变，评估AT1和CaMKII的相互作用。

实验结果
1. 质粒鉴定结果

质粒酶切后电泳结果显示，目的长度DNA片段清晰可见，表明质粒制备成功，浓度与纯度符合要求。

2. 细胞转染与筛选结果

通过磷酸钙盐沉淀法将AT1和CaMKII质粒共转染至COS7细胞后，经过G418抗性筛选，成功获得抗药性的细胞克隆。免疫荧光法和免疫印迹法检测结果显示，转染细胞中AT1和CaMKII蛋白表达阳性，而未转染细胞中则无表达。

3. 功能检测结果

给予转染细胞AngII刺激后，Western blot结果显示，转染AT1和CaMKII/WT的细胞产生p-ERK升高反应，该反应可被AT1受体拮抗剂（ARB）预处理消除。而未转染细胞及转染AT1和CaMKII/DN的细胞无类似反应，进一步证实DN为无功能抑制体。

讨论
1. 磷酸钙盐沉淀法在构建双质粒稳转细胞系中的可行性

本研究成功利用磷酸钙盐沉淀法构建了表达AT1和CaMKII的双质粒稳转COS7细胞系。磷酸钙盐沉淀法因其成本低廉、操作简便而被广泛应用于瞬时转染。本研究通过优化转染条件和筛选策略，成功实现了双质粒共转染和稳转细胞系的构建。这一结果表明，磷酸钙盐沉淀法在构建双质粒稳转细胞系中具有可行性。

2. 双质粒稳转细胞系在基因功能研究中的应用价值

稳转细胞系能够在长时间内稳定表达外源基因，为基因功能研究提供了可靠的平台。本研究构建的双质粒稳转细胞系能够同时表达AT1和CaMKII，为研究二者在细胞信号转导中的相互作用提供了有力的工具。通过给予AngII刺激，观察到p-ERK的改变，进一步证实了AT1和CaMKII在ERK信号通路中的相互作用。这一结果为深入探究AT1和CaMKII的功能及其在疾病发生发展中的作用提供了重要线索。

3. 实验策略的创新性

本研究在实验策略上具有以下创新性：

1. 双质粒共转染：传统磷酸钙盐沉淀法主要用于瞬时转染，本研究通过优化转染条件和筛选策略，成功实现了双质粒共转染和稳转细胞系的构建。
2. 稳转细胞系的构建：利用G418抗性筛选，成功获得抗药性的细胞克隆，为长期稳定的基因表达提供了保障。
3. 功能检测：通过给予AngII刺激，观察p-ERK的改变，为评估AT1和CaMKII的相互作用提供了直接证据。

4. 研究的应用前景

本研究构建的双质粒稳转细胞系具有广泛的应用前景：

1. 基因功能研究：可用于深入研究AT1和CaMKII在细胞信号转导中的相互作用及其调控机制。
2. 药物筛选：可作为模型系统，用于高通量筛选和评估针对AT1和CaMKII的药物药效和安全性。
3. 疾病模型构建：可用于模拟与AT1和CaMKII相关的疾病状态，为疾病机理研究和治疗策略开发提供平台。

结论

本研究成功利用磷酸钙盐沉淀法构建了表达AT1和CaMKII的双质粒稳转COS7细胞系，并验证了其在基因功能研究中的应用价值。实验结果表明，磷酸钙盐沉淀法在构建双质粒稳转细胞系中具有可行性，且构建的双质粒稳转细胞系为深入探究AT1和CaMKII的功能及其在疾病发生发展中的作用提供了有力的工具。本研究为基因功能研究、药物筛选和疾病模型构建提供了新的思路和方法，具有广泛的应用前景。