反相RediSep®柱在肽分离中的应用与优化
肽可以被定义为氨基酸的短链聚合物。单个肽的特性当然取决于其特定的氨基酸组成和排列方式。肽具有相对的极性，其结合特性与其他蛋白质相当一致。
肽混合物可以被分离成单个肽种类。如果可以将这些单独且更具体的肽包含在一个单一的馏分中，这将极大地加速许多科学过程。
以下是一个通用的方法，用于在可重复使用的反相RediSep® C18柱上将肽混合物分离成馏分。
通常最好从4.3克的RediSep反相柱开始。在探索特定肽的良好参数时，会使用较少的肽样品和溶剂。一旦确定了洗脱参数，就可以根据需要扩大过程规模。回顾反相理论的应用说明AN10可能是有益的。
对于本参考文献中使用的特定肽混合物，参数列于表1中。参数将随肽结构而变化。
表格1：通用方法参数
二、通用方法波长
理想的波长会根据肽的结构而变化。选择具有最高灵敏度的波长是理想的，同时避免引入过多噪声或遗漏某些化合物。如果210 nm过于嘈杂，那么214 nm通常会提供一个更干净的基线。环状结构在280 nm处吸收最好，双键在254 nm处，单键在210 nm处。推荐的通用波长对于蛋白质和肽是210 nm。
反离子
为了提高肽和柱的性能，通常使用反荷离子。这有助于提供更均匀的分离，从而改善柱性能。常用的反荷离子是0.1%（体积比）三氟乙酉夋（TFA）。将其等量添加到A和B移动相中。在整个分离过程中保持稳定反荷离子浓度会得到更一致的基线。简单的配制方法是每升移动相中加入1毫升（0.1% v/v）。直接用移液管将TFA加入到移动相中并彳切底混合。
柱负载
这个参数根据肽的组成有很大的变化。对于4.3克的RediSep反相柱，0.5毫克应该是一个好的起点。
柱构造
柱本身由三个主要部分组成：
1. 支持介质是固定相所绑定的固体表面。
2. 固定相是附着在支持介质上的活性涂层，即C18。
3. 移动相是流过支持介质的流体，以便将肽的活性部分暴露给固定相。
移动相或溶剂系统
许多肽强烈地吸附在C18上，通常需要一个强梯度来洗脱。典型地，水用作溶剂A，乙腈用作溶剂B来洗脱肽。
梯度
在建立新方法时，通常建议创建一个从0到95% B溶剂的非常缓慢的梯度，以确保所有峰都被洗脱并且柱子被清洁。
在初始的0-95%梯度运行后，洗脱轮廓大致确定，可以根据特定肽的需要修改梯度。通过在特定的保留时间改变梯度的斜率，可以优化分离时间和峰形。
三、分析结果
图1提供了一个参考肽的色谱图。特定的肽是使用表1中列出的参数进行分离的。参数将随着肽的结构而变化。
图1：样品肽色谱图
四、总结肽的纯化方法可以先在较小的柱上建立，然后根据所需的样品负载量进行放大。
