应用案例解析：如何成功进行活细胞光电关联

Coral Life 提供了简化的活细胞 CLEM 解决方案，用于深入了解细胞成分随时间发生的结构变化。除了工作流程手册中描述的技术处理外，本文还提供了成功进行实验的其他知识。

在本例中，主要关注点是两个有丝分裂细胞的最终分离，即脱落。胞质分裂后，两个分裂细胞仅通过细胞间桥相连，这细胞间桥还需要被进一步研究。由于其体积庞大，活细胞成像无法完全了解这一机制。因此，需要通过超微结构分析来了解最终细胞分离的内在机制。

 

蓝宝石的制备

6 毫米蓝宝石盘需要在实际实验前进行清洁。清洗步骤如下：

1、在通风橱中将蓝宝石盘放入浓盐酸（HCl 30%）中浸泡 2 小时。

2、用双蒸（dd）H₂O 冲洗蓝宝石盘 3 次，每次 5 分钟。

3、之后将蓝宝石盘放在滤纸上晾干。

清洗过程结束后，需要在干净的蓝宝石盘上喷镀出网格图案。这一步至关重要！该图案可确保日后在树脂块中轻松检索样品位置和感兴趣的区域。在蓝宝石上绘制图案的步骤如下：

1、将一个干净的蓝宝石盘放入镀膜安装座的每个相应位置，并在上面添加一个 6 毫米的finder栅格掩模（图1）。Finder 栅格掩膜外围有一个凹槽，用于指示掩膜的方向。所有掩膜应具有相同的方向，以便在后续步骤中始终显示蓝宝石的正确方向。建议将finder光栅掩模放在能产生可读字母的方位。

2、对于掩膜的喷镀，可以使用金或碳。在此，使用 EM ACE 600 碳线以脉冲模式（双线、100 毫米距离、210 瓦、150 毫秒脉冲长度）进行碳涂层。在蓝宝石上沉积了厚度为 10 纳米的碳层。

• 确保关闭旋转。这将使网格图案更加清晰。

• 根据镀膜仪和喷镀技术的不同，可能需要喷镀更厚的碳层才能获得良好的可见度。

• 如果使用碳，不要忘记将碳层稳定在 180 摄氏度以上过夜。

3、现在蓝宝石已准备就绪，可以按照工作流程手册的说明设置 SampLink chamber。确保碳层朝向 SampLink chamber的内部。细胞需要在碳层顶部生长。

图 1：蓝宝石上用于后续喷镀的finder栅格掩模的方向

在将细胞种植到组装好的 SampLink 细胞室之前，需要再次对细胞室进行清洁和灭菌。在细胞培养罩中执行以下步骤：

1、在SampleLink中注入 1 毫升 70% 乙醇并孵育 5 分钟。

2、用 dd H₂O 冲洗 3 次。

3、让其干燥过夜。

4、紫外线灭菌至少 1 小时。

第二天：

1、用 PBS 冲洗 3 次。

2、加入 1 毫升 PBS 或培养基，将SampleLink放入培养箱中过夜。

3、培养结束后用 dd H₂O 冲洗。

SampleLink即可使用。将细胞直接种在蓝宝石上，或种在附加的聚合物或多肽涂层上。在这里，蓝宝石上的碳网格图案上涂有聚-L-赖氨酸（broid P1274，分子量 70,000-150,000 ，Sigma-Aldrich）。涂层用 0.1 mg/ml dd H₂O 稀释。在每块蓝宝石上加入 50μl 5 分钟，然后冲洗（3 次 dd H₂O），并在通风橱中干燥 2 小时。

 

细胞孵育

这些实验使用了在 DMEM 培养基（10 % FCS ，1 % 青霉素/链霉素）中培养和孵育的 HeLa Kyoto HKF1、H2B-mCherry、alphaTubulin、mEGFP 细胞系。

1、每个SampLink chamber培养66,000个细胞，在37°C、5% CO₂ 条件下培养 24 小时。

在标准细胞培养箱中，将 6 个开放的 SampLinks 放入 140 毫米的培养皿中，然后盖上培养皿。在实际成像实验之前，需要将 SampLinks 完全组装好。按照 Coral Life 手册第 5.2.4 节的说明组装 SampLink 室。

如果直接在 OxyGenie 中培养 SampLinks，则需要在播种后直接组装 SampLinks chamber。注意：OxyGenie 需要 30 分钟左右加热。

2、在这些实验中，培养 24 小时后细胞的密度达到约 70%。

活细胞成像

一旦细胞达到所需的密度，6个SampLink  chamber就可以安全地从细胞培养实验室转移到显微镜实验室。

若THUNDER显微镜与SampLink  chamber一起用于成像，以下是一些关于成像参数的提示和技巧：

图 2：这里显示的是螺旋扫描的一部分。在透射光下，碳涂层网格图案清晰可见。

通过定位字母 I、J、O、P（箭头）可以很容易地找到网格图案的中心（星号）。

 

1、设置平台的转移位置，以便之后轻松卸载SampLink chamber进行冷冻。

 

2、生成定位概览：

根据网格图案手动识别蓝宝石片中心（见图2）。

确定后，从中心开始快速螺旋扫描，覆盖整个区域，以获得初步的快速概览。这样可以快速检查方向。此处直接使用 40x 水浸物镜。

为了进一步识别感兴趣的区域，还进行了带焦点图的螺旋扫描。这样做的好处是，如果蓝宝石片或chamber不完全平整，焦点就会得到修正。可以在多个通道中创建带聚焦图的序列扫描（图3）。建议逐个通道运行，完成后再合并。

 

3、完成后，确定感兴趣区域 (ROI)，如图 4 所示。每块蓝宝石片可以使用一个以上的 ROI 进行下游分析。但必须确保区域之间有足够的空间，以便修整或分割树脂块。

图 3：使用 40x/1.1 NA 蓝宝石校正水浸物镜采集的螺旋扫描图。A）透射光；B）荧光通道--510 纳米波长照明。

在本示例中，观察从细胞分裂开始。60 分钟后固定样本。根据相关过程的动态变化，您需要选择不同的成像时间间隔。就本文而言，每分钟 1 张图像足以跟踪细胞分裂和脱落。

A：使用 40x/1.1 NA 蓝宝石校正物镜获得的螺旋扫描图像。B：放大的 A 中圆圈所示区域。感兴趣的分裂细胞位于中心。

 

冷冻替代和包埋

本例中使用的是整体冷冻替代方案。这种技术可在样品内部进行强烈的金属染色，从而在扫描电镜成像时获得良好的对比度。它也可用于 TEM 成像；不过，由于脂质上的强金属堆积，分辨率会略有降低。在高倍放大镜下，样品会显得模糊不清。所使用的冷冻替代液含有 1% OsO4 + 0.2% 醋酸铀酰 + 2.5% H₂O 的纯丙酮。

将样品在液氮下放入冷冻替代液中，然后转移到-90°C的预冷 EM AFS2 系统中：

冷冻替代

• -90°C，在冷冻替代液中放置 48 小时
• 每小时升高 5 摄氏度，直至 -30 摄氏度
• 保持 -30°C 4 小时
• 以 5°C/h 的速度递增，直至 20°C
• 保持 20 摄氏度 5 小时
   

对比

• 在丙酮中清洗 3 x 10 分钟
• 在丙酮中加入 1% 的硫代酰肼，在室温条件下 20 分钟
• 在丙酮中清洗 3 x 10 分钟
• 2% 四氧化锇在丙酮中，室温条件下 20 分钟
• 在丙酮中洗涤 3 x 10 分钟
• 2% 醋酸铀酰，丙酮，60°C，20 分钟
• 在丙酮中清洗 3 x 10 分钟
   

渗透

• 30% Durcupan 在丙酮中浸泡 3 小时
• 70% Durcupan 在丙酮中浸泡 3 小时
• 100% Durcupan 3 小时
• 100% Durcupan 过夜
• 100% Durcupan 3 小时
• 60°C 下聚合 48 小时

 

包埋完成后，将通流环 (16707161) 放入试剂槽 (16700154) 并注入一半的新鲜树脂。将蓝宝石转移到通流环中，用体视显微镜检查finder栅格的可读性（图5）。然后，将通流环完全填满，并将样品放入 60°C 的烘箱中 48 小时。

 

取样和切片

工作流程中最关键的步骤之一是取回树脂块中的 ROI，然后进行修块和成像。为了检查样品是否保存完好，建议在聚合后对树脂块的块面进行快速成像。在本实验中，将光学显微镜的数据与树脂块表面的图像进行了如下关联：

• 将样品从聚合的流动环中取出后，用手术刀从蓝宝石背面刮去残留的树脂薄层
• 用乙醇浸湿的纸巾清除残留碎屑
• 用金属夹具将样品块固定在THUNDER显微镜载物台上，使蓝宝石片（几乎）垂直于显微镜的光轴
• 通过树脂块的透射照明可用于成像
• 或者，也可利用树脂块在蓝光（470纳米）下的自发荧光对细胞进行“背照”
• 首先使用螺旋扫描对树脂块进行定位
• 然后绘制包含 5 个聚焦点的聚焦图和整个块面的图像扫描图
• 将扫描图像与概览图像合并，并导出为 tiff 和 jpg 文件
• jpg 文件可通过 Microsoft Office 的成像工具以正确的放大率叠加到活细胞图像上；使用 tiff 文件和 Fiji 软件可完成更复杂的叠加程序

图 5：左：透过蓝宝石拍摄的块面透射光图像。右图 块面图像与之前活体成像的相应荧光图像的叠加。

注：在高压冷冻过程中，单个细胞或有时成批细胞从蓝宝石上脱落是正常现象。高密度或与基底结合不牢固的细胞（即有丝分裂细胞，因为它们会变圆，因此与基底的附着点会减少）会产生这种效果。使用较低的细胞密度和/或不同类型和浓度的涂层可以减少玻璃化过程中细胞的损失。

 

然后将蓝宝石从块面上剥离：

1、首先修剪掉蓝宝石周围过多的树脂。这可以用厚重的刀片来完成。

2、加热 EM MP 系统 (16705403)，准备一个装有 LN2 的小杜瓦瓶。

3、用镊子夹住树脂块

4、将树脂块正面朝下放在热的 EM MP 上 10-20 秒。

5、然后将树脂块直接浸入液氮中冷却。您会听到“咔嚓”一声。

6、用体视显微镜观察时，将锋利的刀片插入树脂和蓝宝石片之间。蓝宝石片应该很容易与树脂分离。否则，请重复加热/冷却步骤。

7、移除蓝宝石片后，您应该仍能观察到区块上的碳图案。

利用finder栅格的网格图案，您可以在区块上找到 ROI 并将其修剪下来。在这里，使用 EM TRIM2 对包埋块进行了修整。

在本例中，由于只有 5-7 个部分包含目标特征，因此必须进行序列切片。因此，切片被安装在slot grids上。由于使用了整体冷冻替代和渗透方案，因此无需进行后期染色。

图 6：分裂的 HeLa 细胞的合并 TEM 图像，仍由细胞间桥连接。样品用 Morgagni 80 kV TEM（ Thermo Fisher）成像。

图 7：分裂的 HeLa 细胞的 TEM 图像，仍由细胞间桥连接。

 

数据后处理

本实验使用THUNDER技术对原始数据进行后处理。要了解有关THUNDER技术的更多信息，以及如何在 Coral Life 工作流程中使用THUNDER技术进行后处理和定位，请扫码查阅应用说明：“如何使用 Coral Life 改进活细胞成像”。

图 8：A) 感兴趣细胞的标准 WF 图像，使用绿色和红色荧光通道成像。B) 使用THUNDER小体积计算技术对数据进行后处理。

 

图像相关性

最终的图像相关性取决于每个实验的要求，可以是将不同的图像结果并排放置，也可以是更详细的二维和三维图像相关性，从而提取超微结构和活细胞数据之间的关系。在本例中，创建了 LM 和 EM 数据的叠加。为了进行匹配叠加，需要在光学显微镜和电子显微镜图像上放置地标。为此，需要叠加无褶皱变形的图像。

 

光学显微镜和电子显微镜图像的叠加。

图 9：光学显微镜和电子显微镜图像的叠加。

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