抑制膜修复蛋白膜联蛋白-A2可防止肿瘤侵袭和转移

Inhibition of the membrane repair protein annexin-A2 prevents tumor invasion and metastasis

Keywords: Annexins; AsPC-1; Invasion; MDA-MB-231; Metastasis; S100 proteins; Tumor progression.

在暴露于机械应力的细胞中，质膜破坏是一种经常发生的生理事件，特别是在肌肉、上皮细胞或内皮细胞中，分别受到肌肉收缩/拉伸以及血流动力学剪切应力的影响。这些细胞具有膜修复机制，能够在一分钟之内重新修复损伤。膜修复障碍会导致细胞死亡，并可能导致退行性疾病的发展，如肌营养不良。Ca2+ 从细胞外（mM）流入细胞内（μM）环境是膜修复的主要触发因素，膜修复主要依赖于以 Ca2+ 依赖性方式结合膜的蛋白质，如dysferlin、AHNAK、S100家族成员、ESCRT机制或膜联蛋白。

哺乳动物的膜联蛋白家族是胞质蛋白，它们以Ca2+ 依赖性方式与带负电荷的磷脂（例如磷脂酰丝氨酸）结合，在不同阶段参与膜修复。膜联蛋白-A2（ANXA2）有望提供一个相关的靶点，因为它促进了各种癌症类型的进展，包括乳腺癌、胰腺癌或胶质母细胞瘤。此外，ANXA2在许多细胞类型（包括癌细胞）的膜修复中起着至关重要的作用。

癌症转移是由一系列事件引起的，这些事件导致疾病通过血液或淋巴从原发肿瘤扩散到其他器官。在这些过程中，癌细胞暴露于永久性机械应力下，这些应力在几何形状、规模和强度上都发生了变化，这取决于它们参与的转化。从原发肿瘤的体积压缩开始，当转移细胞在血流中移动时，机械限制演变为血流动力学和机械剪切应力，最后当它们到达非常狭窄的血管并发展到整个内皮细胞的外渗时，演变为粘附性拉伸和紧密性收缩。这些机械应力很容易在癌细胞中造成质膜破坏，亟需一种有效的膜修复机制来应对这种损伤，这将为开发新的治疗策略开辟道路，以阻止肿瘤侵袭和转移。

去年，法国波尔多大学及法国国家科学研究中心和法国国家与健康医学研究院的科研团队开展了评估癌细胞中关键膜修复蛋白的抑制是否会影响体内肿瘤进展的研究。这项研究使用了具有高度侵袭性和转移性的三阴性乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 和胰腺癌细胞系AsPC-1，发现当将这些细胞注射到小鼠或斑马鱼中时，ANXA2的基因抑制可以阻止肿瘤侵袭和转移过程；并证明ANXA2 的缺失可抑制癌细胞对剪切应力的反应，这导致细胞由于缺乏膜修复而死亡；而且ANXA2单克隆抗体干扰了ANXA2在癌细胞膜修复中的功能，表明它可能构成抑制肿瘤侵袭和转移的相关工具。研究成果发表在 Cellular and Molecular Life Sciences 期刊题为“Inhibition of the membrane repair protein annexin-A2 prevents tumor invasion and metastasis”。

通过沉默ANXA2 的表达，检测了 shANXA2 MDA-MB-231 和 shANXA2 AsPC-1 细胞在体外修复膜损伤的能力（图1 C-F）。蛋白质印迹证实，shANXA2细胞中，ANXA2蛋白表达强烈降低（图1 C ），且沉默 ANXA2 表达后细胞形态没有显著差异（图1 D ）。此外，ANXA2 缺失对细胞增殖没有影响，但可能会轻微干扰体外迁移。

为了确认 MDA-MB-231 和 AsPC-1 细胞的膜修复需要 ANXA2，在 Ca2+ 和FM1-43 存在下进行了膜修复测定。在对照MDA-MB-231或AsPC-1细胞中，观察到FM1-43在激光损伤后几秒钟内进入细胞的膜照射部位，证实了膜破裂的存在（图1 E）。120 秒后，大多数受损细胞表现出细胞内荧光的增加（图1 E），强度增加约60s后达到平台期（图1 F），表示质膜的快速重新密封。相反，shANXA2 MDA-MB-231或shANXA2 AsPC-1细胞的荧光强度增加幅度要大得多（图1 G-F），表示没有质膜重封。

为了测试 ANXA2 是否被募集到损伤部位，用 ANXA2-GFP 载体转染 shANXA2 MDA-MB-231 细胞，并通过激光消融分析膜损伤后 ANXA2 的细胞内运输，观察到ANXA2-GFP在几秒钟内被一致地募集到膜破坏位点（图1 H、I）。这些数据表明，ANXA2 是 MDA-MB-231 和 AsPC-1 细胞膜修复所必需的。

图1 ANXA2在MDA-MB-231细胞中高度表达，促进膜修复。

接下来，检测了剪切应力后膜修复的差异。在没有Ca2+ 的情况下，13.6±2.3%的细胞在暴露于剪切应力后未修复，该值远高于没有应用剪切应力时（0.7±0.5%）（图2 B、E、F）。Ca2+ 存在时，该值下降到3.8±1.9%，表明约 70% 的对照细胞能够修复膜损伤（图2 B、E、F）。电子显微镜观察剪切应力处理后MDA-MB-231细胞的形态，发现承受剪切应力的许多细胞在 Ca2+ 存在下似乎已经裂解，在没有Ca2+ 的情况下这种现象会增加，表明这是由未修复的膜损伤引起的。这些结果表明，剪切应力会造成膜损伤，其修复需要Ca2+。

然后，检测了沉默ANXA2表达后对剪切应力的响应。在 Ca2+ 存在时，11.3 ± 5.9% 的 shANXA2 MDA-MB-231 细胞在剪切应力下未能修复其膜，与没有 Ca2+ 时对照细胞的值相似（图2 C、E、F），在ANXA2沉默的AsPC-1细胞中也观察到这种膜修复缺陷。电子显微镜观察到大多数shANXA2 MDA-MB-231细胞似乎已经裂解，就像没有Ca2+ 一样。这些结果强烈表明，剪切应力会导致膜损伤，其修复需要ANXA2。

此外，实验还检查了抗-ANXA2抗体抑制膜修复的能力。研究假设抗体会通过被破坏的膜进入细胞，并通过中和 ANXA2 来抑制膜修复。对照 MDA-MB-231 细胞在 Ca2+ 和单克隆抗ANXA2抗体存在下承受剪切应力。结果观察到，8.7% ± 3.0% 的未修复细胞，明显高于在 Ca2+ 存在下受损的对照细胞的值，并推断抗-ANXA2抗体的存在导致剪切应力后膜修复缺陷（图2 D-F）。抗-ANXA2抗体在膜修复中的抑制作用在AsPC-1细胞中也得到证实。因此得出结论，ANXA2 是响应剪切应力的关键成分，并且抗-ANXA2 抗体尽管在细胞外给药，但可以抑制膜修复。

图2 对照和shANXA2 MDA-MB-231细胞对剪切应力下膜损伤的反应。

最后，研究人员使用transwell侵袭测定法讨论了ANXA2沉默对MDA-MB-231和AsPC-1细胞迁移的影响（图3 A ）。在没有ANXA2的情况下，覆盖有基质胶和胶原蛋白插入物的下腔室中的MDA-MB-231细胞数量分别减少了72% 和 62%（图3 B）。类似的结果在AsPC-1细胞中观察到。这表明，ANXA2 的缺失降低了 MDA-MB-231 和 AsPC-1 细胞的侵袭性。

此外，为了研究 ANXA2 在肿瘤进展中的作用，用荧光素酶报告基因标记对照和 shANXA2 MDA-MB-231 细胞，并将细胞注射到 NOD SCID 小鼠和RAG小鼠的尾静脉中，发现缺乏ANXA2的细胞在肺部的定植效率要差得多，并且无法移植到骨骼中。这说明，ANXA2是小鼠转移所必需的。为了确认 ANXA2 缺失细胞转移的较低倾向，将对照或shANXA2 MDA-MB-231细胞和对照或shANXA2 AsPC-1细胞注射到斑马鱼幼虫的卵黄囊中，并量化在鱼尾部和/或头部形成的转移，也证实了ANXA2是斑马鱼细胞植入和转移所必需的。

图3 ANXA2缺乏会损害MDA-MB-231细胞的侵袭。

总之，该研究表明，膜联蛋白-A2（ANXA2）是侵袭性乳腺癌和胰腺癌细胞膜修复所必需的。从机制上讲，通过荧光和电子显微镜表明，当 ANXA2 沉默或被中和抗体抑制时，细胞无法重新密封剪切应力造成的损伤膜。沉默ANXA2对体外增殖没有影响，甚至可能加速伤口愈合试验中的迁移，但会减少小鼠和斑马鱼中的肿瘤细胞扩散。研究人员预测，抑制膜修复在对侵袭性、预后不良的肿瘤中特别有效，因为它们依靠膜修复机制在肿瘤侵袭和转移期间来维持膜损伤。这可以通过抗-ANXA2抗体来实现，抗-ANXA2抗体已被证明可以抑制乳腺癌和胰腺癌细胞的转移，也可以使用小分子药物来实现。

参考文献：Gounou C, Rouyer L, Siegfried G, Harté E, Bouvet F, d'Agata L, Darbo E, Lefeuvre M, Derieppe MA, Bouton L, Mélane M, Chapeau D, Martineau J, Prouzet-Mauleon V, Tan S, Souleyreau W, Saltel F, Argoul F, Khatib AM, Brisson AR, Iggo R, Bouter A. Inhibition of the membrane repair protein annexin-A2 prevents tumor invasion and metastasis. Cell Mol Life Sci. 2023 Dec 13;81(1):7. doi: 10.1007/s00018-023-05049-3. PMID: 38092984; PMCID: PMC10719157.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38092984/

Impact factor 6.2 (2023)

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