文献解读：GSK3调控信号影响牛骨骼肌纤维/脂肪生成祖细胞的成脂分化
期刊：Biological Macromolecules
影响因子：7.7
伯豪试剂产品：伯优®细胞核分离试剂盒
研究背景
骨骼肌发育与肉用动物的生产力和肉质密切相关，骨骼肌是重要的食物来源。理解控制骨骼肌组成、发育和生长的遗传和生理机制对提高肉质具有重要意义。已有研究表明，肌内脂肪（IMF）的沉积与肌肉功能障碍、相关疾病和肉质密切相关。理解IMF沉积的调控机制及其影响对改善肉质至关重要，而肌卫星细胞（MuSCs）、侧群细胞和成纤维/成脂祖细胞（FAPs）参与异位脂肪生成。单核RNA测序（snRNA-seq）允许对单个细胞的转录组进行深度测序，用于评估细胞群体的异质性，识别稀有细胞类型。探索骨骼肌的细胞组成，以及不同细胞间的差异，以此揭露其对多细胞生物功能的影响。
伯豪产品
伯优®细胞核分离试剂盒
研究目的
通过单核RNA测序（snRNA-seq）揭示延边牛不同发育阶段骨骼肌细胞的异质性，探讨肌内脂肪细胞的起源及其沉积机制，Wnt/GSK3/β-catenin信号通路在FAPs成脂过程中的作用，对肌卫星细胞（MuSCs）成肌分化的影响。
研究结果
1. 单核RNA测序揭示不同发育阶段牛骨骼肌细胞的异质性
为了获得牛骨骼肌发育的细胞群体图谱并表征细胞异质性，我们对从出生后（D8）和成年（M18）牛骨骼肌组织获得的单核细胞悬液进行了基于液滴的单核RNA测序（snRNA-seq）。在过滤掉7720个捕获自D8的细胞后，剩余的7638个细胞根据相似的基因表达模式被归类为15个细胞簇。这些15个簇包含16至1520个细胞，占分析细胞总数的0.21%至19.9%，其中簇0是最大的亚群，簇14是最小的亚群。同时，M18形成了13个分离的簇，包含26至2019个细胞，占分析细胞总数的0.28%至21.91%。基于先前确定的标记物的表达，并使用t分布随机邻域嵌入（t-SNE）可视化数据确定了细胞种类，。通过此分析，我们确定了骨骼肌中的所有主要细胞类型，包括肌细胞、平滑肌、成纤维/脂肪生成祖细胞（FAPs）、卫星细胞（SCs）、成肌细胞、免疫细胞和内皮细胞，以及肌细胞的一个罕见功能特化区域——神经肌肉接头（NMJ）。通过表达规范标记基因，包括PDGFRA、DCN（FAPs）、PLN（平滑肌）、CD163和PTPRC（免疫细胞）识别非肌核簇。肌核群体的基因表达包括MYH1、CKM（肌细胞）、Pax3、Pax7（LOC532669）（SCs）、MyoD1、MYF5、SPOCK1（成肌细胞）。NMJ核为已知规范标记MUSK阳性。
2. 使用snRNA-seq鉴定牛骨骼肌发育过程中的细胞异质性
基于D8和M18的snRNA-seq数据的整合分析，并使用Seurat3.0通过识别锚点的方法校正批次数据，比较分析D8和M18两个发育阶段细胞簇。另外，还比较了不同发育阶段每个簇中细胞的比例，并观察到了阶段之间细胞组分比例的显著变化。结果显示，出生后牛骨骼肌中肌细胞亚群的比例为77.02%。随着骨骼肌的发育，成年牛骨骼肌中肌细胞亚群的比例为85.33%，增加了1.11倍。然而，在成年牛骨骼肌中，簇6中的FAPs（D8:7.53%，M18:4.58%）和簇8中的SCs（D8:3.94%，M18:1.44%）的比例分别下降了39.17%和63.45%。
3. 肌源性细胞亚群的轨迹推断分析
使用Monocle算法进行的轨迹推断分析揭示了FAPs、平滑肌和SCs之间的关系。根据伪时间分析的结果，簇6中的FAPs被确定为初始状态。在骨骼肌发育过程中，簇6中的一部分FAPs转变为簇5中的平滑肌细胞，而一小部分转变为簇8中的SCs。研究将前50个差异基因被分为六类，展示了决定预分支细胞向细胞命运1和细胞命运2状态分化的基因，显示了每个细胞状态中高度可变基因的趋势，并指出了三个细胞亚群之间的分化关系。
对D8和M18牛骨骼肌中FAPs共表达基因的分析显示，PDE1A、LVRN、COL4A1、COL4A2、EBF2和MEG3等基因发生了显著变化。基于GO富集分析，发现这些基因主要参与脂质结合、醛氧化酶活性、FAD结合、血小板衍生生长因子结合等生物学过程。此外，高表达的COL4A1和COL4A2基因主要富集在细胞外基质-受体相互作用、蛋白质消化和吸收、泛酸和CoA生物合成以及钙信号传导通路中。
4. 从延边牛骨骼肌中纯化FAPs和MuSCs
基于表面标记物PDGFRα、CD56、CD29等的表达，通过磁激活细胞分选（MACS）从延边牛骨骼肌中分离出FAPs和MuSCs。RT-qPCR结果显示，与MuSCs相比，FAPs中PDGFRα的表达显著增加，而Pax7的表达显著下降。同样，免疫荧光染色也观察到FAPs中PDGFRα蛋白特异性表达，MuSCs中检测到Pax7和MyoG的表达。
5. GSK3抑制剂LY2090314激活Wnt/β-catenin信号通路抑制FAPs的脂肪生成
FAPs是表达主要Wnt配体和受体的细胞群。为了进一步研究Wnt/β-catenin通路在牛肌肉来源FAPs中的作用，研究选择了GSK3抑制剂LY2090314和TNKS抑制剂XAV-939来激活和抑制Wnt/β-catenin通路。β-catenin的免疫染色显示，LY2090314处理96小时后促进了β-catenin从细胞质向细胞核的转位。在LY2090314阻断GSK3表达并激活Wnt/β-catenin通路后，FAPs中三酰甘油（TAG）和脂联素（ADP）的浓度显著降低，脂滴的形成也受到高度限制。研究还观察到脂肪生成基因（PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ和FABP4）和甘油三酯合成基因（DGAT1和DGAT2）的下调。此外，Western blotting显示，在LY2090314处理后，FAPs脂肪生成中FAP抗原PDGFRα、PPARγ和C/EBPα的表达显著下降。这些结果表明，GSK3/β-catenin通路调节FAPs的脂肪生成，LY2090314通过阻止β-catenin的降解来抑制FAPs的脂肪分化。
6. XAV-939阻断Wnt/β-catenin信号通路促进FAPs的脂肪生成
1 μM XAV-939处理显著抑制了Ctnnb1的转录水平，而GSK3A和GSK3B的mRNA表达水平没有显著差异。此外，在抑制Wnt/β-catenin通路后，β-catenin的表达显著下降，与脂肪生成相关的基因和蛋白（PPARγ、C/EBPα、FABP4、DGAT）的表达增加，表明β-catenin的下调信号FAPs会促进脂肪生成。此外，与对照组相比，XAV-939处理显著增加了FAP中脂滴的聚集和填充，TAG和ADP的含量增加。
7. LY2090314激活Wnt/GSK3/β-catenin通路，增强MuSCs的自我更新和肌生成
为了进一步研究β-catenin对牛MuSCs分化的影响，研究使用了20 nM 外源性LY2090314处理细胞，同时在MuSCs分化过程中监测了β-catenin和磷酸化β-catenin表达的动态变化。Western blot结果显示，随着MuSCs分化时间的延长，pβ-catenin（T41）的表达下降，而β-catenin的表达增加。此外，20 nM LY2090314处理促进了β-catenin的稳定，延长了牛MuSCs的分化时间。EdU掺入分析显示，LY2090314处理后的前24小时内，EdU+细胞比例较高，MyoG的表达下降。虽然分化48小时后肌管形成减少，但是，分化72小时后肌管的融合指数显著增加，表明LY2090314可以促进MuSCs的更新和分化。LY2090314抑制GSK3活性并激活Wnt/β-catenin通路以促进β-catenin的稳定，显著增加了肌源性基因（MyoD、MyoG、MRF4和MYF5）的mRNA表达。Western blotting显示，Pax7的表达下调，而MyHC和MyoG的表达水平显著上调。相反，在1 μM XAV-939处理后，与MuSCs肌生成相关的基因和蛋白（MyoD、MyoG、MRF4和MyHC）的表达显著下降。
8. 3.8. GSK3抑制剂LY2090314激活Wnt/β-catenin信号通路增强FAPs在体外共培养系统中刺激MuSCs成肌的能力
为了研究Wnt/β-catenin通路对体外共培养系统中MuSCs分化的影响，使用了FAPs来源的条件培养基（CM）与MuSCs进行共培养。RT-qPCR结果显示，与未经处理的FAPs相比，经20 nM LY2090314处理的FAPs显著促进了成肌基因（MyHC、MyoD、MyoG、MRF4和MYF5）的表达。此外，LY2090314处理还显著提高了FST基因的表达。然而，用1 μM XAV-939处理的FAPs消除了FAPs对MuSCs的成肌效应，MyHC、MyoD和MyoG蛋白的表达水平下降。MyHC免疫染色显示，经20 nM LY2090314处理的FAPs的肌管融合指数达到71.46%，而1 μM XAV-939处理的仅为38.02%。
研究总结
本研究通过单核RNA测序（snRNA-seq）技术分析了延边牛骨骼肌在不同发育阶段的细胞异质性和转录特征，揭示了成纤维/脂肪生成祖细胞（FAPs）在肌内脂肪沉积中的作用及Wnt/β-catenin信号通路对FAPs成脂分化的调控机制。通过鉴定延边牛骨骼肌在两个发育阶段的8种细胞亚群，包括肌细胞、平滑肌细胞、FAPs、卫星细胞（SCs）等，发现FAPs在肌内脂肪沉积中起关键作用，表达主要Wnt配体和受体。GSK3抑制剂LY2090314通过激活Wnt/β-catenin信号通路，抑制FAPs的成脂分化，促进肌卫星细胞（MuSCs）的自我更新和成肌分化，而Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂XAV-939则促进FAPs的成脂分化。这一研究为改善牛肉品质提供了新的理论依据和潜在靶点，有助于未来通过调控FAPs的成脂分化来提升肉品质
原文链接：
https://doi.org/10.7554/eLife.92046
