中乔新舟从原代培养到建立永生细胞系的方法总结
原代细胞的培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。原代细胞是可以真实地反映特定细胞在体内的生理状态。但是它们一般传了很少的代数就会停止增殖并死亡。对于一些需要大量细胞进行的实验比如生化分解，遗传筛选等，无法使用原代细胞。因此在体外建立永生细胞以研究细胞生长、分化和衰老是很重要的。本文简单介绍中乔新舟从原代培养到建立永生细胞系的方法。
三个方案可供选择：
实验流程如下：
方案一：SV40 LargeT 介导的永生化细胞
许多病毒基因是可以影响细胞周期的，目前常用的方法是使用SV40 T抗原来诱导永生化。SV40 T抗原已被大量细胞验证是细胞永生化最简单有效的试剂，其机制相对容易理解。SV40（simian virus 40）是猿猴肾细胞病毒，SV40编码两种肿瘤抗原 (tumor antigen，T抗原)，分别为大T抗原和小T抗原。T抗原的作用是：①大T抗原为细胞转化的启动所必需;②转化细胞表型的维持必需要有大T抗原的连续表达;③小T抗原对于细胞的转化不是必需的，但可起加强作用。因此，SV40 Large T 能使细胞进入永生化的增殖状态，缺点是存在潜在的致癌风险，可能引起细胞恶性转化。(如中乔新舟：货号：ZQ1099 名称是huvec-Immortalized人脐静脉内皮细胞-永生化的细胞等)。下图是CV40基因组DNA的构成元件和永生化的进程：
Figure 1. (a) Structure of SV40 genomic DNA is composed of three elements: the early and late coding units and the regulatory region. (b) Several domains and motifs make up the SV40 T antigens. (c) A brief overview of the process of SV40 induced immortalized transformation. (Ahuja D,2005)
方案二：hTERT介导的永生化细胞
端粒中含有一种逆转录酶（TERT），它能催化作为模板的端粒酶反转录为端粒DNA，继而合成到染色体末端，不断弥补端粒的长度，使细胞持续生长。然而，正常细胞中通常不表达TERT。为了实现细胞永生化，需要使用转基因技术构建表达载体，将TERT转染到细胞中。
Figure 2．端粒酶延长的激活（图片来自网络）
hTERT是人端粒酶蛋白部分的催化亚基编码基因，与端粒酶活性呈现正相关。为了使原代细胞获得永生化同时维持正常细胞的生理特性，我们将原代细胞转染人端粒酶逆转录酶cDNA（hTERT），从而激活端粒酶活性，维持端粒长度，阻止染色体端粒降解，诱导细胞永生化。在高传代数和使用致癌基因时，hTERT永生化细胞忠实地代表了体内正常细胞的生理特性。
方案三：复合型病毒感染介导的永生化细胞
在某些细胞类型中，仅使用一种永生化方法可能无法产生永生细胞，或者有些细胞不适合端粒酶介导的方法，因此，根据不同的细胞系，最好结合抑制细胞周期和hTERT的表达来永生更多的细胞。这就需要用到复合型病毒感染，通过慢病毒转染的方式携带SV40T及hTERT基因，这种方法综合了上述两种方法的优缺点，可能既保持了原始特性，也避免核型发生变异。如：ZQY008人胰腺星状细胞-永生化；ZQY009 人肝内胆管上皮细胞-永生化等细胞。
此外获得永生化细胞的方法还有基因编辑技术，化学诱导，物理（穿刺）细胞等技术，中乔新舟原代细胞永生化均通过慢病毒转染的方式单独或者混合携带SV40T及hTERT基因来获得。中乔新舟提供上百种人源及动物源的永生化细胞株，以及上百种永生化细胞培养基供科研工作者选择使用。
永生化细胞应用领域
1. 药物筛选和开发：永生化细胞是药物筛选和毒性测试的理想模型。通过使用这些细胞，可以在实验室中快速、大规模地进行药物筛选，评估药物的有效性和安全性。
2. 基因研究和功能验证：由于这些细胞能够长期增殖，它们成为了研究基因功能和细胞信号通路的重要工具，特别是在基因表达调控、细胞周期、癌症等领域。
3. 癌症研究：许多永生化细胞系源于癌细胞，癌细胞的永生化特性使其成为研究癌症发生、发展及治疗的关键模型，帮助科学家理解癌症的生物学机制。
4. 抗体生产：永生化细胞，如CHO细胞，被广泛用于单克隆抗体和重组蛋白的生产，这对于生物药物的发展具有重要意义。
三个方案可供选择：
实验流程如下：
方案一：SV40 LargeT 介导的永生化细胞
许多病毒基因是可以影响细胞周期的，目前常用的方法是使用SV40 T抗原来诱导永生化。SV40 T抗原已被大量细胞验证是细胞永生化最简单有效的试剂，其机制相对容易理解。SV40（simian virus 40）是猿猴肾细胞病毒，SV40编码两种肿瘤抗原 (tumor antigen，T抗原)，分别为大T抗原和小T抗原。T抗原的作用是：①大T抗原为细胞转化的启动所必需;②转化细胞表型的维持必需要有大T抗原的连续表达;③小T抗原对于细胞的转化不是必需的，但可起加强作用。因此，SV40 Large T 能使细胞进入永生化的增殖状态，缺点是存在潜在的致癌风险，可能引起细胞恶性转化。(如中乔新舟：货号：ZQ1099 名称是huvec-Immortalized人脐静脉内皮细胞-永生化的细胞等)。下图是CV40基因组DNA的构成元件和永生化的进程：
Figure 1. (a) Structure of SV40 genomic DNA is composed of three elements: the early and late coding units and the regulatory region. (b) Several domains and motifs make up the SV40 T antigens. (c) A brief overview of the process of SV40 induced immortalized transformation. (Ahuja D,2005)
方案二：hTERT介导的永生化细胞
端粒中含有一种逆转录酶（TERT），它能催化作为模板的端粒酶反转录为端粒DNA，继而合成到染色体末端，不断弥补端粒的长度，使细胞持续生长。然而，正常细胞中通常不表达TERT。为了实现细胞永生化，需要使用转基因技术构建表达载体，将TERT转染到细胞中。
Figure 2．端粒酶延长的激活（图片来自网络）
hTERT是人端粒酶蛋白部分的催化亚基编码基因，与端粒酶活性呈现正相关。为了使原代细胞获得永生化同时维持正常细胞的生理特性，我们将原代细胞转染人端粒酶逆转录酶cDNA（hTERT），从而激活端粒酶活性，维持端粒长度，阻止染色体端粒降解，诱导细胞永生化。在高传代数和使用致癌基因时，hTERT永生化细胞忠实地代表了体内正常细胞的生理特性。
方案三：复合型病毒感染介导的永生化细胞
在某些细胞类型中，仅使用一种永生化方法可能无法产生永生细胞，或者有些细胞不适合端粒酶介导的方法，因此，根据不同的细胞系，最好结合抑制细胞周期和hTERT的表达来永生更多的细胞。这就需要用到复合型病毒感染，通过慢病毒转染的方式携带SV40T及hTERT基因，这种方法综合了上述两种方法的优缺点，可能既保持了原始特性，也避免核型发生变异。如：ZQY008人胰腺星状细胞-永生化；ZQY009 人肝内胆管上皮细胞-永生化等细胞。
此外获得永生化细胞的方法还有基因编辑技术，化学诱导，物理（穿刺）细胞等技术，中乔新舟原代细胞永生化均通过慢病毒转染的方式单独或者混合携带SV40T及hTERT基因来获得。中乔新舟提供上百种人源及动物源的永生化细胞株，以及上百种永生化细胞培养基供科研工作者选择使用。
永生化细胞应用领域
1. 药物筛选和开发：永生化细胞是药物筛选和毒性测试的理想模型。通过使用这些细胞，可以在实验室中快速、大规模地进行药物筛选，评估药物的有效性和安全性。
2. 基因研究和功能验证：由于这些细胞能够长期增殖，它们成为了研究基因功能和细胞信号通路的重要工具，特别是在基因表达调控、细胞周期、癌症等领域。
3. 癌症研究：许多永生化细胞系源于癌细胞，癌细胞的永生化特性使其成为研究癌症发生、发展及治疗的关键模型，帮助科学家理解癌症的生物学机制。
4. 抗体生产：永生化细胞，如CHO细胞，被广泛用于单克隆抗体和重组蛋白的生产，这对于生物药物的发展具有重要意义。
