Zyxin对足细胞的稳定和功能的重要性—尤其在机械拉伸期间

Zyxin is important for the stability and function of podocytes, especially during mechanical stretch

Subject terms: Cell biology, Kidney, Kidney diseases, Cytoskeleton, Mechanisms of disease

全世界超过 10% 的人口患有慢性肾病（CKD）。糖尿病和高血压是导致终末期肾病（ESRD）发展的主要原因，常与肾小球有关。高血压被认为会特异性地损害足细胞，足细胞是肾小球中一种终末分化的上皮细胞类型，具有较大的细胞体、延伸突起和足突（FP），贴附于肾小球基底膜（GBM）表面。为了防止肾小球高血压引起的足细胞脱离和损伤，了解负责的机械传感器是必不可少的。研究已经发现，培养的足细胞具有机械敏感性，并且机械应力和流动诱导的剪切应力会改变它们的肌动蛋白细胞骨架以及基因表达。然而，负责肌动蛋白重组的机械传感器仍然未知。

斑联蛋白（Zyxin）是一种重要的黏着斑（FA）和肌动蛋白相关蛋白，已被描述为在细胞对机械力的反应中起重要作用。Zyxin 是一种锌结合磷蛋白，有一个N-末端的富含脯氨酸结构域和三个在其C-末端的一半LIM结构域。据报道，Zyxin 的 N 末端结合辅肌动蛋白α-actinin、细胞骨架效应蛋白 Ena/VASP及LIM 和 SH3 结构域蛋白1（LASP-1）和拉伸应力敏感蛋白p130Cas。特别是，Zyxin 的 LIM 结构域对暴露于单轴拉伸的细胞中的肌动蛋白结合和应力纤维定位至关重要。这可能足以在细胞迁移过程中产生力诱导的 Zyxin 积累。

在体内，Zyxin 被描述为防止高血压引起的心功能障碍以及发挥机械传感器的功能。最近，德国格赖夫斯瓦尔德大学医学院解剖和细胞生物学系、海德堡大学心血管生理学系及汉堡-埃彭多夫大学医学中心的研究团队调查了Zyxin在机械拉伸的足细胞（肾小球高血压模型）中的作用，描述了Zyxin在体外机械拉伸期间对有丝分裂后足细胞的粘附，以及体内维持肾脏过滤是必不可少的。研究成果发表在Communications Biology 期刊题为“Zyxin is important for the stability and function of podocytes, especially during mechanical stretch”。

首先，研究Zyxin在培养的小鼠足细胞中的表达，发现 Zyxin 与黏着斑蛋白以及肌动蛋白纤维共定位。

为了确定机械拉伸是否调节Zyxin的表达，将足细胞暴露于拉伸应力3天（0.5Hz，5%伸长率），通过免疫荧光染色和qRT-PCR分析Zyxin在拉伸（STR）和未拉伸（US）足细胞中的表达。结果发现，由于机械拉伸，Zyx mRNA水平有轻微但显著的增加。此外，足细胞肌动蛋白细胞骨架由于机械拉伸从横向应力纤维重组为径向应力纤维，而且机械拉伸还诱导了沿肌动蛋白丝以及肌动蛋白富集中心（ARC）的Zyxin定位增加。

然后研究了Zyxin在暴露于机械应力3天的足细胞中的作用，生成Zyxin敲除足细胞系（Zyx-KO），并在相同条件下拉伸Zyx-KO和对照足细胞（Ctrl）（图1 a、b），发现机械拉伸后，Zyx-KO足细胞的细胞丢失比对照组更高（图1 d）。然而，机械拉伸对拉伸诱导的 F-肌动蛋白细胞骨架重组和剩余 Zyx-KO 足细胞的 ARC 形成没有影响（图1 c）。这表明，Zyxin 敲除足细胞在机械拉伸后细胞粘附降低，细胞丢失增加。

为了研究机械应力下细胞粘附降低是否是由于黏着斑蛋白的丢失，分析确定了Zyx-KO足细胞中典型黏着斑（FA）蛋白talin、vinculin和paxillin的表达水平。与对照组相比，Zyx-KO足细胞的vinculin蛋白和mRNA水平显著降低，但talin 和paxillin 的表达不受 Zyxin 敲除的显著影响（图1 e、f）。此外，Zyxin的丢失显著影响了FAs的大小（图1 g），vinculin 的单个 FA 面积大小显著减小。talin 的 FA 大小保持不变，paxillin阳性黏着斑甚至扩大。此外，机械拉伸条件下，vinculin的平均FA大小的降低更为明显（图1 h）。

为了找出其他受 Zyxin 调控的蛋白，对Ctrls 和Zyx-KO 足细胞克隆进行了蛋白质组学分析，发现与对照组相比，Zyx-KO 足细胞中检测到 71 种显著上调蛋白和 105 种下调蛋白（图1 i），图1 k显示了前 25 种上调和下调的蛋白质。值得注意的是，Zyx-KO足细胞中GO簇被强烈下调，这与细胞粘附或肌动蛋白丝组织有关（图1 j）。

图1 zyxin KO足细胞的鉴定及蛋白质组学分析。

接下来，研究了 Zyxin 对 zyxin-结合蛋白 VASP 表达的影响，发现Zyx-KO足细胞VASP的蛋白水平较对照组显著降低，但其他肌动蛋白相关蛋白，如filamin A、α-actinin-1，的表达不受Zyxin丢失的影响。此外，Zyx-KO足细胞中，VASP向肌动蛋白丝的募集似乎被破坏，这表明VASP以Zyxin依赖性方式被募集到肌动蛋白应力纤维中。蛋白质组学数据进一步显示，Zyx-KO足细胞中GO簇“肌动蛋白丝组织”的显著调控，特别是，SIRPA（酪氨酸蛋白磷酸酶非受体型底物1）和IQGAP2（Ras GTPase激活样蛋白）的蛋白和mRNA水平显著升高。

蛋白质组学数据表明，细胞外基质（ECM）蛋白在 Zyx-KO 足细胞中显著下调（图2 a）。因此，分析了特异性ECM蛋白的mRNA水平，发现Nid2、Thbs1和Postn的 mRNA 水平显著降低（图2 b）。通过免疫染色和Western blot分析 Zyxin 的丢失是否也会影响纤连蛋白的表达（图2 c、d），发现与对照相比，Zyx-KO足细胞中纤连蛋白的蛋白水平显著降低，特异性纤连蛋白受体整合素α5的表达也显著降低，但整合素β1的蛋白质水平没有变化（图2 d）。

由于 Zyxin 缺乏会显著降低 ECM 蛋白的表达，因此实验还研究了 Zyxin 在细胞铺展中的作用，将 Ctrl 和 Zyx-KO 足细胞的大小进行量化（图2 e），发现与对照相比，Zyx-KO足细胞在粘附的初始阶段细胞铺展和细胞大小都有所减少（图2 e）。此外，Zyx-KO足细胞的迁移速度和距离显著增加（图2 f）。

根据 Zyx-KO 足细胞中 fascin-1 蛋白的显著降低，研究人员推测丝状伪足的发育是由于Zyxin的丢失而改变的，因此分析了Zyx-KO和Ctrl足细胞的蛋白质组数据，发现除 Cdc42 外，许多参与丝状伪足形成的必需蛋白在 Zyx-KO 足细胞中显著下调，且其中丝状伪足的数量和平均长度均减少。

图2 Zyx-KO足细胞显示细胞外基质蛋白的表达降低。

最后，为了弄清楚Zyxin是否在DN患者中也受到调控，实验分析了其在患者肾小球中的mRNA表达，并与微小病变肾病（MCD）患者和健康者的mRNA水平进行了比较。结果观察到，与对照组织相比，DN 患者的 ZYX mRNA 显著增加，MCD患者的Zyxin表达没有显著变化（图3 b），对人类疾病数据的分析进一步证实（图3 c）。此外，在患有DN合并高血压的患者肾小球足突中，Zyxin和突触足蛋白（Synaptopodin）的共定位很强（图3 a）。虽然健康者和 MCD 患者的 Zyxin 仅在足细胞中略有表达，但在 DN 患者中高表达（图3 a）。此外，在DN患者中，Zyxin表达特异性增加足细胞（图3 d）。此外，数据分析表明，在局灶节段性肾小球硬化（FSGS）患者中，Zyxin表达与蛋白尿显著相关，但与MCD患者和（图3 g）和血压（图3 h）不相关。

此外，在Zyxin 敲除后通过PAS染色分析了肾小球，在 6 个月时检测到系膜的扩张。肾小球硬化的评估证实了Zyx KO小鼠的肾小球损伤。进一步确定足突形态的变化，发现在Zyx KO小鼠中，与对照小鼠相比，狭缝隔膜密度显著降低。通过电子显微镜确认肾小球的形态变化，观察到 Zyx KO 肾小球中的部分足细胞足突消失、假性囊肿、系膜细胞扩张和肾小球基底膜增厚。此外，与野生型小鼠相比，雄性 Zyx KO 小鼠的蛋白尿显著增加。

图3 Zyxin在糖尿病肾病和高血压小鼠中上调

这项研究强调了Zyxin对足细胞的重要作用。Zyxin 的体外丢失降低了 vinculin、VASP 和基质蛋白的表达；在小鼠中，Zyxin 的敲除导致蛋白尿和足细胞足突的消失。综上所述，该研究表明Zyxin 是一种重要的蛋白质，对体外和体内足细胞的稳定性和功能至关重要，尤其是在机械拉伸下。

参考文献：Kliewe F, Siegerist F, Hammer E, Al-Hasani J, Amling TRJ, Hollemann JZE, Schindler M, Drenic V, Simm S, Amann K, Daniel C, Lindenmeyer M, Hecker M, Völker U, Endlich N. Zyxin is important for the stability and function of podocytes, especially during mechanical stretch. Commun Biol. 2024 Apr 11;7(1):446. doi: 10.1038/s42003-024-06125-5. PMID: 38605154; PMCID: PMC11009394.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38605154/

Journal Impact Factor: 5.2

ISSN 2399-3642 (online)

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