机械反应性导致静脉曲张内皮功能障碍和动脉化

Mechanoresponsive ETS1 causes endothelial dysfunction and arterialization in varicose veins via NOTCH4/DLL4 signaling

Keywords: ETS; Endothelium; Notch; Shear stress; Therapeutics; Varicose veins.

慢性静脉疾病，通常称为静脉曲张，其特征是静脉血回流不足，严重的临床表现包括出血和皮肤溃烂经久不愈。最近的研究报告称，静脉曲张与静脉血栓栓塞和外周动脉疾病的高风险有关。

当静脉暴露于流量较高或血流变化的循环时，会发生组织学变化，例如内膜增生、管壁增厚、静脉内皮标志物丢失和动脉内皮标志物表达。这个过程称为异常静脉动脉化。研究表明，隐静脉的动脉化有助于静脉曲张的发病机制。此外，发现与Notch信号通路相关的动脉内皮标志物，如DLL4、HEY2和ephrin B2，在静脉曲张中增加。静脉曲张中功能失调的单向瓣膜和静脉壁扩张会导致血流动力学改变，尽管在发病机制的初级阶段是很微妙的。同时，血压和剪切应力等生物力学力是Notch信号传导的公认决定因素，然而，力检测的机制及其与Notch激活的耦合是未知的。

静脉血流力学调节Notch信号传导的机制知之甚少。最近，机械敏感的 E26 转化特异性序列-1（ETS1）被证明与 Notch 复合物结合并诱导内皮 NOTCH1 和 NOTCH4 受体以及 DLL4 配体。ETS1表达及其DNA结合活性与高动脉剪切应力相关。

最近，印度拉吉夫-甘地生物技术中心及Sri Jayadeva 心血管科学研究所的课题团队研究了ETS1在人静脉曲张中的表达模式，发现了 ETS1 如何在扰动流体剪切应力下调节静脉 ECs中 Notch 受体及其相应配体的表达谱。此外，还检查了与对照隐静脉相比，静脉曲张中活化Notch受体和其配体的表达是否增强以及静脉血流紊乱是否在与静脉动脉化相关的分子变化中起作用。研究成果发表在 European Journal of Cell Biology 期刊题为“Mechanoresponsive ETS1 causes endothelial dysfunction and arterialization in varicose veins via NOTCH4/DLL4 signaling”。

首先，为了在静脉曲张发病机制的背景下检查Notch信号，使用qRT-PCR分析了静脉曲张和对照隐静脉中Notch受体和配体的相对基因表达。结果表明，与健康静脉相比，静脉曲张中的NOTCH1（1.41倍）、NOTCH3（1.47倍）和NOTCH4（2.42倍）显著上调，编码Notch配体（如DLL3、DLL4和JAG1）的基因也上调。组织学分析表明，与正常静脉相比，静脉曲张的内层增厚，具有明显的内膜形成，表明静脉壁动脉化。免疫染色分析显示，活化的裂解Notch受体（NICD1、NICD3、NICD4）和DLL4和JAG1在静脉曲张中的表达显著升高。通过蛋白质印迹和密度测定法进一步定量了对照静脉和静脉曲张中NICD4 和 DLL4 的表达，发现它们在静脉曲张中的上调具有统计学意义。

然后，评估了 ETS1 在静脉曲张和对照静脉中的表达。结果表明，静脉曲张中ETS1 mRNA转录本上调（1.86倍），表明ETS1在疾病进展中起关键作用（图1 A）。ETS1 通过其苏氨酸-38 残基的磷酸化而被激活。使用 ETS1 pThr38 和 ETS1 总抗体的蛋白质印迹分析显示，磷酸化的 ETS1（pETS1）在静脉曲张组织匀浆中的表达显著高于正常静脉（图1 B、C）。

免疫组化定位显示，细胞核pETS1在人静脉曲张的所有组织层中均有显著表达（图1 D、E），但对照静脉中没有ETS1的核表达。通过验证pETS1的亚细胞定位，发现ETS1确实定位于细胞核，并在静脉曲张的新内膜区域密集染色，而在对照静脉中未显著显示其表达（图1 D、F、G）。此外，在对照静脉和静脉曲张中共定位 EC 标志物 CD31 与 pETS1，发现与对照静脉相比，CD31 在静脉曲张中显著下调，然而，在静脉曲张中，细胞质 CD31 与核 pETS1 共表达。

图1 静脉曲张中 ETS1 的上调。

接下来，将血管内皮细胞珠EA.hy926 暴露于剪切应力（6 dyne/cm2）以探索机械敏感 Notch 蛋白和 ETS1 在各种流体流动条件下的潜在表达。细胞经受不同的剪切应力状态（静态、PF 和 DF），以模拟正常和受影响静脉中管腔内皮对血流模式的反应。qRT-PCR分析不同剪切应力条件下细胞中NOTCH1-4、Notch配体（DLL3、DLL4、JAG1、JAG2）和ETS1的基因表达（图2 A），发现扰动剪切应力（DF）在静脉 ECs 中诱导 NOTCH4、DLL4、JAG1和 ETS1的显著表达（图2 A）。

蛋白质印迹分析证实，与均匀平行流动（PF）和静态条件相比，DF细胞中活化的NOTCH4（NICD4）和DLL4表达稳定增加（图2 B）。与平行流动的细胞相比，暴露于DF的细胞中活化的pETS1的表达显著升高（图2 C）。为了评估 EA.hy926 细胞的完整性，检测了EC 标志物 CD31 和 eNOS，发现与PF和静态细胞相比，DF细胞中CD31和活化的peNOS蛋白逐渐减少（图2 B、C）。

对暴露于流动条件的 ECs 进行 NICD1、NICD4、pETS1 和 DLL4 的免疫荧光分析，发现NICD1 在静态、PF 或 DF 的细胞中均无差异（图2 D、E）。这些结果证实了暴露于各种流动条件的细胞中的NOTCH1 mRNA的水平。NICD1虽然是一种内皮型，但在静态、PF或DF的细胞中没有差异（图2 D、E），然而，暴露于 DF 的 NICD4 和 pETS1 的表达显著增加，并有明显的核定位（图2 D、E、F）。Notch 配体 DLL4 表现出广泛的细胞质表达模式。尽管 ETS1 mRNA 在暴露于 DF 的细胞中高表达，但 ETS1 总蛋白的差异表达在不同流动条件的细胞中并不显著（图2 B）。

图2 ETS1-Notch4/DLL4 在扰动流体剪切应力下静脉内皮细胞（EC）中的信号转导。

最后，为了进一步了解 ETS1 苏氨酸38 在静脉血流改变下的磷酸化机制，研究人员探索了某些抑制剂，如 U0126（MEK1/2 抑制剂）、BIX02189（MEK5 抑制剂）和 SB203580（P38 MAPK 抑制剂）对暴露于 DF 的 ECs 的影响。结果表明，U0126 显著降低 pETS1 核表达，突出了 MEK1/2 信号在 ETS1 激活中的重要性。在随后的扰动剪切应力刺激下，U0126 处理的细胞中 pETS1 降低。MEK5 抑制剂也导致 pETS1 减少，表明 MEK1/2 和 MEK5 在响应 DF 的 ETS1 磷酸化中存在潜在的相互作用。然而，P38 MAPK通路似乎在DF下的pETS1表达中没有作用。这表明，扰动流主要通过 MEK1/2 级联诱导 ETS1。

然后，敲低 EA.hy926 细胞中 ETS1 的表达，将有或没有 ETS1 敲低（ETS1KD）的 ECs 暴露于剪切应力。当 ETS1KD ECs 受到扰动剪切应力时，ETS1 mRNA 水平持续降低（图3 B）。此外，在扰动流条件下，ETS1 的缺失显著降低了 NICD4 和 DLL4 蛋白水平（图3 A）。

使用 TK216（ETS抑制剂）化学抑制 ETS1 结合活性，发现NICD4和DLL4水平降低，与ETS1KD细胞所观察的一致（图3 C）。此外，与扰动剪切应力下的对照siRNA转染细胞相比，ETS1KD细胞中的NICD4和DLL4蛋白分别降低了5.75倍和4.49倍；与未处理和DF 处理24小时的细胞相比，TK216处理的ECs分别降低了5.27倍和6.44倍（图3 D）。值得注意的是，即使在 DF 下，用 TK216 处理也会导致内皮基因的表达升高，特别是 eNOS、VE-钙粘蛋白和 vWF（图3 E）。这些数据表明，暴露于静脉血流紊乱的细胞中 ETS1 的分子和化学抑制消除了 Notch 信号。

图3 pETS1 促进静脉内皮细胞（EC）中剪切应力诱导的 Notch 活化。

图4 图形概要

总之，该研究目前的研究结果为扰动静脉剪切应力在静脉曲张中诱导异常 NOTCH4/DLL4 信号传导中的作用提供了宝贵的见解。机械敏感转录因子 ETS1 已被确定为 NOTCH4/DLL4 诱导的静脉曲张信号的激活剂，可能是调节静脉曲张动脉化的有希望的靶标。

参考文献：Sreelakshmi BJ, Karthika CL, Ahalya S, Kalpana SR, Kartha CC, Sumi S. Mechanoresponsive ETS1 causes endothelial dysfunction and arterialization in varicose veins via NOTCH4/DLL4 signaling. Eur J Cell Biol. 2024 May 11;103(2):151420. doi: 10.1016/j.ejcb.2024.151420. Epub ahead of print. PMID: 38759515.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38759515/

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