机械诱导的细胞代谢破坏了SAOS-2骨肉瘤细胞的氧化应激稳态

Mechano-induced cell metabolism disrupts the oxidative stress homeostasis of SAOS-2 osteosarcoma cells

Keywords: cyclic stretch; mechanobiology; metabolomics (LC-MS); osteosarcoma; oxidative stress response.

人体不断受到物理力的影响，这些力会改变决定细胞行为的分子特性。在实体瘤进展过程中，细胞会经历维持迁移的机械和代谢变化。然而，关于细胞的代谢状态如何影响其恶性特征，反之亦然，目前知之甚少。

骨肉瘤（OS）是最普遍的原发性骨肿瘤。OS细胞的机制生物学研究发现，它们响应于几种细胞外力学刺激的变化来调节其恶性肿瘤。研究已经确定了细胞外信号与化疗失败之间的密切联系，设想了细胞外刺激可以调节细胞毒性的可能。骨微环境已被证明在OS的发生、进展和复发中起着至关重要的作用。鉴于已知大多数化疗药物会增加细胞内活性氧（ROS）的浓度，并可能破坏癌细胞内的氧化还原平衡，因此，机械力有助于细胞中的细胞毒性过程是一个合理的假设。通常，大多数癌细胞中发生的代谢改变被认为有助于肿瘤发展，并介导对化疗药物的耐药性，尤其是，OS中细胞代谢的改变，这已经被报道与OS恶性肿瘤的等级相关。

基于此，意大利图西亚大学生态与生物科学系和罗马第二大学临床科学与转化医学系的课题团队在一项研究中利用一种机械方案（24 h，1 Hz，0.5% 伸长率的循环拉伸），通过使用非靶向质谱方法确定SAOS-2 细胞中机械力诱导的代谢改变。由于几种机械刺激被报道通过多种机制增加自由基（如活性氧和氮）的产生，代谢组学分析也集中在氧化应激稳态的机械调节上。此外，对参与氧化应激防御的一些机械敏感的细胞保护基因如SOD1，SIRT1，FOXO1和Nrf2的表达水平进行了比较分析，并确认了机械诱导的代谢变化是否有助于骨肉瘤SAOS-2细胞对化疗药物阿霉素诱导的死亡变得更加敏感。研究成果发表在 Frontiers in Molecular Biosciences 期刊题为“Mechano-induced cell metabolism disrupts the oxidative stress homeostasis of SAOS-2 osteosarcoma cells”。



 将人骨肉瘤 SAOS-2 细胞暴露于特定的中等幅度单轴循环拉伸应变方案（1 Hz，0.5%，24h），进行非靶向代谢组学分析以评估由这种机械刺激诱导的细胞代谢变化。火山图分析表明，与未刺激的 SAOS-2 细胞（Ctrl对照）相比，机械拉伸细胞中有 48 种代谢物显著下调，25 种代谢物显著上调，主要表现为甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸和赖氨酸等氨基酸的变化。氨基酸水平的增加表明其在循环拉伸细胞的能量产生和核苷酸合成中起着核心作用。

为了详细研究单轴循环拉伸对能量代谢的机械调控，比较了暴露于或未暴露于0.5%伸长率单轴循环拉伸24 h的SAOS-2细胞的糖酵解（EMP）、戊糖磷酸途径（PPP）和三羧酸循环（TCA）。结果观察到，机械拉伸细胞中葡萄糖-6-磷酸（G6P）丰度的增加（图1），乳酸积累显著减少，证实了循环拉伸应用可以逆转 SAOS-2 细胞中的 Warburg 效应（指癌细胞代谢优先采用糖酵解代谢而不是氧化磷酸化代谢以生成能量）。由于PPP和EMP 在代谢上有关联，共享共同的中间产物G6P，糖酵解的增加同时导致PPP速率降低，反之亦然。正如预期的那样，这强调了 1 Hz 刺激的细胞中葡萄糖从EMP 转移到 PPP 中。

图1 与对照（Ctrl）相比，机械刺激（1 Hz）样本中属于糖酵解和磷酸戊糖途径的中间体积累的变化。

与未处理的细胞相比，拉伸刺激的 SAOS-2 细胞中，在一些单个氨基酸浓度水平及其相关途径的水平上也检测到显著差异，如谷胱甘肽代谢的下调。转硫途径对谷胱甘肽的产生有显著贡献，它涉及将源自蛋氨酸和叶酸循环产生的同型半胱氨酸转化为半胱氨酸，再通过一系列途径生成谷胱甘肽。有趣的是，研究结果显示，与对照组相比，拉伸细胞中与蛋氨酸循环有关的代谢物下调（图2）。

 除上述氨基酸外，丝氨酸和甘氨酸也是这些代谢所必需的。丝氨酸转化为甘氨酸的过程涉及维生素B6 作为必需辅酶。这些途径分别对核苷酸合成和甲基供体 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的生成很重要。因此，观察到的机械诱导的丝氨酸、甘氨酸和维生素 B6 的生物活性形式的上调，使研究人员能够假设这些代谢物不会通过叶酸循环供给蛋氨酸循环。相对于静态组，拉伸刺激细胞中 SAM 和 S-腺苷同型半胱氨酸水平的降低也证实了这一假设，因此它们不参与核苷酸合成和 GSH 的产生。

图2 机械诱导的氨基酸和维生素B6代谢的中间体积累的变化。

由于代谢组学分析显示了机械处理的 SAOS-2 细胞中氧化应激增加的几个显着特征，因此，实验评估了 24 h+1 Hz 机械刺激是否伴随着细胞间 ROS 的产生。与静态对照相比，机械刺激诱导了1.89倍的ROS 过量生成（图3 A）。为了评估机械和化学刺激对 ROS 生成的协同作用，将拉伸预处理的细胞与 ROS 诱导剂阿霉素（一种目前用于骨肉瘤治疗的化疗药物）一起孵育。同时进行的机械和化学刺激显示，ROS的生成增加；8.6 μM阿霉素处理SAOS-2-细胞24小时后ROS生成增加5倍（图3 A）。因此，化学诱导的ROS生成掩盖了SAOS-2细胞中静态和拉伸诱导的ROS生成调节之间的差异。

基于取得的结果，实验还假设拉伸诱导的氧化应激稳态的破坏可能导致机械预处理的 SAOS-2 细胞发生细胞毒性致敏。因此，采用阿霉素来测试骨肉瘤细胞对死亡的抵抗力，用1.25-10 μM范围内不同浓度的阿霉素处理预拉伸和对照细胞。结果发现，在两种情况下，SAOS-2 细胞都以剂量依赖性方式死亡（图3 B），然而，预拉伸细胞的死亡率更高。这表明，1 Hz+24 h拉伸处理可使骨肉瘤细胞对阿霉素诱导的死亡更敏感。

由于 SOD1、SIRT1、Nrf2 和 FOXO-1 是机械敏感基因，在对抗氧化应激中起重要作用，因此使用实时 PCR 测量了其基因表达水平。结果表明，24 h+1 Hz 机械刺激没有显著干扰 FOXO1 的表达水平，但诱导了 SOD1 基因的上调，并同时下调了转录因子基因 SIRT1 和 Nrf2表达水平。这些结果表明，1 Hz 拉伸处理增加了细胞ROS生成和SAOS-2细胞对阿霉素的敏感性。
 

图3 机械诱导的SAOS-2细胞系活性氧和细胞毒性的上调。
 

图4 SAOS-2 细胞中拉伸诱导变化的示意图：上图。细胞形态：整个细胞在循环拉伸应变后伸长率增加，导致 SAOS-2 细胞的大小显著增加，细胞核质比（N/C）破坏。下图：基因表达水平：虽然成骨分化标志物（即 ALP、COL1、RUNX-2）的表达水平不受机械刺激的影响，但目前数据显示与未刺激的细胞相比，机械刺激的细胞中 SIRT1 和 Nrf2 下调，SOD1 上调。代谢状态：机械刺激与Warburg效应的逆转、谷氨酰胺代谢的上调、GSH耗竭、细胞内ROS积累和PPP的上调有关，同时与核苷酸合成的下调有关。

总之，目前基于LC-MS的代谢组学分析显示，在机械1 Hz刺激后，SAOS-2细胞中的代谢物发生了不同的显著改变。通路分析表明，机械刺激细胞的能量代谢被破坏，其特征是糖酵解和三羧酸循环显著下调，但氨基酸代谢也失调（即谷氨酰胺分解增强，蛋氨酸循环减少）。反过来，在机械诱导的 GSH 耗竭和 ROS 富集的支持下，研究数据表明，机械拉伸处理可以诱导氧化应激稳态水平的增加，从而使 SAOS-2 细胞对阿霉素诱导的细胞死亡敏感。这些发现有助于细致地了解SAOS-2细胞对机械刺激的复杂反应，为细胞行为、转移和对治疗药物敏感性的潜在影响提供了有价值的见解。

参考文献：Fanelli G, Alloisio G, Lelli V, Marini S, Rinalducci S, Gioia M. Mechano-induced cell metabolism disrupts the oxidative stress homeostasis of SAOS-2 osteosarcoma cells. Front Mol Biosci. 2024 Apr 25;10:1297826. doi: 10.3389/fmolb.2023.1297826. PMID: 38726050; PMCID: PMC11079223.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38726050/

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Electronic ISSN 2296-889X

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