运动通过 FUNDC1-依赖性线粒体自噬保护老龄小鼠免受冠状动脉内皮衰老
椎间盘疾病（IVDD）是最普遍的脊柱退行性疾病之一。由于长时间站立和肥胖导致的椎间盘（IVD）机械超负荷已被广泛认为是 IVDD 的重要原因，而髓核（NP）承担了 75% 的压力。然而，机械超负荷诱导 IVDD 的具体机制尚未阐明。
谷胱甘肽过氧化酶4（GPX4）是主要的脂质过氧化物清除剂，在铁死亡中起着关键的调节作用。据报道，由机械超负荷激活的 Piezo1 离子通道导致的钙内流增强诱导 GPX4-调控的铁死亡。已发现位于内质网膜（ER）的 Piezo1 的激活通过诱导ER的钙离子释放来增加细胞内游离钙。然而，机械超负荷是否会同时激活位于质膜和内质网膜上的 Piezo1 离子通道以升高 NP 细胞内游离 Ca2+ 的水平，从而导致 GPX4 调控的铁死亡仍有待确定。
硒蛋白K（SelK）是一种ER蛋白，已被证明与内质网应激和细胞抗氧化性有关。硒（Selenium）是一种必需的微量营养素，参与了抗氧化应激的保护。补充硒可以上调各种硒蛋白的表达，并且在滤泡辅助性T细胞中证明了 Selenium-GPX4 轴对铁死亡的保护作用。然而，目前还没有关于补硒是否可以通过上调 NP 细胞中的 SelK 和 GPX4 来减轻铁死亡的报道。
最近，在山东大学齐鲁医院骨科、病理科及美国布莱根妇女医院骨科的一项联合研究中，计划探索机械超负荷是否通过激活位于质膜和内质网膜上的 Piezo1 离子通道来阻碍 GPX4 的产生，从而导致 NP 细胞中的铁死亡。在上述过程中，研究员将确定促进 ER 应激的因素以及ER应激在铁死亡中的具体作用，此外，将验证补充硒是否可以通过上调 GPX4 和 SelK 来减轻机械超负荷诱导的 NP 细胞铁死亡。研究成果发表在 Cellular and Molecular Life Sciences 期刊题为“Selenium-SelK-GPX4 axis protects nucleus pulposus cells against mechanical overloading-induced ferroptosis and attenuates senescence of intervertebral disc”。
首先，实验评估了自然增龄和衰老条件下 FUNDC1 表达的变化。8周龄幼鼠冠状动脉组织中的 FUNDC1 蛋白水平随着年龄的增长逐渐降低。18 月龄的老年小鼠 FUNDC1 水平显著降低（图1 A、B），促衰老的炎症因子 IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 水平显著增强（图1 C）。同样，在衰老的内皮细胞中也观察到 FUNDC1 的表达降低，IL-6 和 TNF-α 水平较高（图1 F）。
进一步构建 FUNDC1 内皮特异性敲除（Fundc1fl/Y/Tek-Cre）小鼠。ECs 中的 FUNDC1 缺失损害了 ACh 诱导的血管舒张，但不损害 SNP，表明 FUNDC1 负责维持冠状动脉中正常的内皮依赖性血管舒张功能（图1 G）。MI/R 之后，FUNDC1 基因敲除小鼠中积累的 Gr-1+ 中性粒细胞明显增加（图1 H），表明在 MI/R 损伤后中性粒细胞迁移和内皮通透性增加。eNOS 磷酸化和 VEGF 表达降低以及 ET-1 上调也表明 FUNDC1 敲除小鼠的内皮功能障碍（图1 I、J）。重要的是，EC 特异性 FUNDC1 敲除加重了 MI/R 后心脏收缩功能降低（图1 K）。这些数据表明，低 FUNDC1 表达导致冠状动脉功能障碍和 MI/R 损伤恶化。
接下来，为了阐明运动对年龄相关的 FUNDC1 下调和冠状动脉功能的影响，研究者对比了接受4 周规律运动和久坐不运动的老年小鼠。结果表明，FUNDC1 蛋白在运动小鼠的冠状动脉组织中显著上调，且 ACh 诱导的冠状动脉扩张显著增强，表明运动诱导的内皮依赖性血管舒张得到改善。在进行 MI/R 后，运动的老年小鼠的 Gr-1+ 中性粒细胞迁移减少，且炎症标志物（如IL-6、IL-8和TNF-α）和粘附分子（如VCAM-1、ICAM-1）等均显著降低，表明运动保护 MI/R 在衰老中诱发的微血管高通透性。此外，老年运动小鼠的 eNOS 磷酸化恢复，ET-1 水平降低，且缺血危险区的血管生成显著增加，左室收缩功能有所增强，也减轻了 MI/R 后的心脏损伤。这些数据表明，运动可防止随着年龄增长而下调的 FUNDC1 和冠状动脉功能障碍，并减少衰老心脏 MI/R 损伤的恶化。
为了检查运动对内皮衰老和功能的作用，对运动或久坐的老龄小鼠原代心脏微血管内皮细胞（CMECs）进行 SA-β-gal 染色。结果表明，老年小鼠 SA-β-gal 活性明显上升，而运动显著降低了这些水平，且逆转了衰老标志物 p21 和 p53 在老年 CMECs 中的水平。在老年小鼠 CMECs 中观察到相当高的衰老程度，但运动显著逆转了 CMECs 的衰老，改善了 CMECs 的血管生成能力。这表明，运动缓解了内皮衰老和功能障碍。
进一步地，实验探讨了线粒体损伤是否与衰老相关的内皮功能障碍有关。在老龄小鼠 CMECs 中观察到堆积的线粒体 ROS 和异常的线粒体膜电位，与久坐的小鼠相比，在运动老龄小鼠的 CMECs 中这些效应被减轻（图2 A、B）。老龄小鼠的 CMECs 在用 FCCP（一种线粒体自噬诱导剂）处理时表现出线粒体自噬受损。衰老导致整体红色 mt-Keima 荧光显著降低（图2 C、D），线粒体 LC3-II 水平降低，p62 水平升高，但这些效应通过运动逆转（图2 E、F）。重要的是，衰老 CMECs 中受损的线粒体自噬是被运动保留（图2 C-F）。老龄小鼠 CMECs 中线粒体自噬受体 FUNDC1 的水平也被证实较低，并且在运动老龄小鼠中恢复其表达（图2 G、H）。这些数据表明，运动减少了衰老 CMECs 的线粒体损伤并恢复了线粒体自噬。
为了验证 FUNDC1 在运动诱导的冠状动脉保护中的作用，实验对 Fundc1fl/Y 和 Fundc1fl/Y/Tek-Cre 小鼠进行为期4周的定期运动训练。结果发现，运动改善 Fundc1fl/Y 小鼠 MI/R 后内皮细胞屏障功能、增强血管新生，改善心脏功能。然后在内皮细胞中过表达 FUNDC1，观察到 FUNDC1 过表达显著降低了 CMECs 中 SA-β-gal 活性，表明过表达的线粒体自噬受体 FUNDC1 逆转了内皮细胞衰老。因此，FUNDC1 过表达改善了 EC 功能，如管形成、迁移和增殖能力。此外，与运动的保护作用一致，FUNDC1 过表达增强了 ACh 刺激的冠状动脉舒张、保护内皮屏障的完整性，恢复了老龄小鼠的 eNOS 磷酸化和 VEGF 表达，并降低了 ET-1 水平。重要的是，AAV-FUNDC1 治疗显著改善了 MI/R 后的心脏收缩功能。这说明，FUNDC1 过表达逆转了内皮衰老和功能障碍。
层流诱导的层流剪切应力（LSS）增加是运动诱导的内皮适应的重要机制。研究者利用层流装置来评估运动过程中 FUNDC1 基因表达的调控机制，并潜在鉴定启动 FUNDC1 转录的转录因子。生物信息学预测表明，FUNDC1 含有 PPARγ 反应元件 （PPRE）（图3 A）。先前的研究表明，层流激活了 ECs 中的 PPARγ。因此，实验评估了层流是否以 PPARγ 依赖性方式增强了 CMECs 中 FUNDC1 基因的表达。ChIP 检测表明，PPARγ 与 CMECs 中的 FUNDC1 启动子区域相互作用（图3 B）。为了验证这一发现，用 PPARγ 特异性拮抗剂 GW9662 预处理 CMECs，并暴露于 20 dyne/cm2 的层流剪切力中持续6小时。在 GW9662 处理下，层流诱导的 LSS 增加了 CMECs PPARγ DNA-结合活性，抑制了流动诱导的 PPARγ 活性（图3 C）。此外，GW9662 显著减弱了 FUNDC1 的表达，但在静态条件下没有，表明 PPARγ 参与剪切力诱导的 FUNDC1 基因表达（图3 D）。此外，与久坐小鼠相比，运动的老年小鼠血管组织中的 PPARγ 表达和活性增强（图3 E、F）。这些数据表明，PPARγ 在 CMECs 中负责层流调控的 FUNDC1 表达。
总之，该研究表明，上调的 FUNDC1 和恢复的线粒体自噬有助于减少衰老过程中运动诱导的内皮衰老和 MI/R 损伤，运动过程中 PPARγ 在调节 FUNDC1 表达中起重要作用。抑制 FUNDC1 本身会导致内皮衰老，并消除运动对内皮细胞和 MI/R 损伤的保护作用。鉴于这些发现，FUNDC1 可能是一个有希望的靶点，用于维持内皮线粒体稳态、防止内皮衰老，并可能通过血管内皮与心脏组织机制的“串扰”减少 MI/R 损伤（图3 G）。
参考文献：Ma L, Li K, Wei W, Zhou J, Li Z, Zhang T, Wangsun Y, Tian F, Dong Q, Zhang H, Xing W. Exercise protects aged mice against coronary endothelial senescence via FUNDC1-dependent mitophagy. Redox Biol. 2023 Jun;62:102693. doi: 10.1016/j.redox.2023.102693. Epub 2023 Apr 1. PMID: 37030149; PMCID: PMC10113862.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37030149/
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谷胱甘肽过氧化酶4（GPX4）是主要的脂质过氧化物清除剂，在铁死亡中起着关键的调节作用。据报道，由机械超负荷激活的 Piezo1 离子通道导致的钙内流增强诱导 GPX4-调控的铁死亡。已发现位于内质网膜（ER）的 Piezo1 的激活通过诱导ER的钙离子释放来增加细胞内游离钙。然而，机械超负荷是否会同时激活位于质膜和内质网膜上的 Piezo1 离子通道以升高 NP 细胞内游离 Ca2+ 的水平，从而导致 GPX4 调控的铁死亡仍有待确定。
硒蛋白K（SelK）是一种ER蛋白，已被证明与内质网应激和细胞抗氧化性有关。硒（Selenium）是一种必需的微量营养素，参与了抗氧化应激的保护。补充硒可以上调各种硒蛋白的表达，并且在滤泡辅助性T细胞中证明了 Selenium-GPX4 轴对铁死亡的保护作用。然而，目前还没有关于补硒是否可以通过上调 NP 细胞中的 SelK 和 GPX4 来减轻铁死亡的报道。
最近，在山东大学齐鲁医院骨科、病理科及美国布莱根妇女医院骨科的一项联合研究中，计划探索机械超负荷是否通过激活位于质膜和内质网膜上的 Piezo1 离子通道来阻碍 GPX4 的产生，从而导致 NP 细胞中的铁死亡。在上述过程中，研究员将确定促进 ER 应激的因素以及ER应激在铁死亡中的具体作用，此外，将验证补充硒是否可以通过上调 GPX4 和 SelK 来减轻机械超负荷诱导的 NP 细胞铁死亡。研究成果发表在 Cellular and Molecular Life Sciences 期刊题为“Selenium-SelK-GPX4 axis protects nucleus pulposus cells against mechanical overloading-induced ferroptosis and attenuates senescence of intervertebral disc”。
首先，实验评估了自然增龄和衰老条件下 FUNDC1 表达的变化。8周龄幼鼠冠状动脉组织中的 FUNDC1 蛋白水平随着年龄的增长逐渐降低。18 月龄的老年小鼠 FUNDC1 水平显著降低（图1 A、B），促衰老的炎症因子 IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 水平显著增强（图1 C）。同样，在衰老的内皮细胞中也观察到 FUNDC1 的表达降低，IL-6 和 TNF-α 水平较高（图1 F）。
进一步构建 FUNDC1 内皮特异性敲除（Fundc1fl/Y/Tek-Cre）小鼠。ECs 中的 FUNDC1 缺失损害了 ACh 诱导的血管舒张，但不损害 SNP，表明 FUNDC1 负责维持冠状动脉中正常的内皮依赖性血管舒张功能（图1 G）。MI/R 之后，FUNDC1 基因敲除小鼠中积累的 Gr-1+ 中性粒细胞明显增加（图1 H），表明在 MI/R 损伤后中性粒细胞迁移和内皮通透性增加。eNOS 磷酸化和 VEGF 表达降低以及 ET-1 上调也表明 FUNDC1 敲除小鼠的内皮功能障碍（图1 I、J）。重要的是，EC 特异性 FUNDC1 敲除加重了 MI/R 后心脏收缩功能降低（图1 K）。这些数据表明，低 FUNDC1 表达导致冠状动脉功能障碍和 MI/R 损伤恶化。
图1 随着年龄的增长，FUNDC1水平降低。
接下来，为了阐明运动对年龄相关的 FUNDC1 下调和冠状动脉功能的影响，研究者对比了接受4 周规律运动和久坐不运动的老年小鼠。结果表明，FUNDC1 蛋白在运动小鼠的冠状动脉组织中显著上调，且 ACh 诱导的冠状动脉扩张显著增强，表明运动诱导的内皮依赖性血管舒张得到改善。在进行 MI/R 后，运动的老年小鼠的 Gr-1+ 中性粒细胞迁移减少，且炎症标志物（如IL-6、IL-8和TNF-α）和粘附分子（如VCAM-1、ICAM-1）等均显著降低，表明运动保护 MI/R 在衰老中诱发的微血管高通透性。此外，老年运动小鼠的 eNOS 磷酸化恢复，ET-1 水平降低，且缺血危险区的血管生成显著增加，左室收缩功能有所增强，也减轻了 MI/R 后的心脏损伤。这些数据表明，运动可防止随着年龄增长而下调的 FUNDC1 和冠状动脉功能障碍，并减少衰老心脏 MI/R 损伤的恶化。
为了检查运动对内皮衰老和功能的作用，对运动或久坐的老龄小鼠原代心脏微血管内皮细胞（CMECs）进行 SA-β-gal 染色。结果表明，老年小鼠 SA-β-gal 活性明显上升，而运动显著降低了这些水平，且逆转了衰老标志物 p21 和 p53 在老年 CMECs 中的水平。在老年小鼠 CMECs 中观察到相当高的衰老程度，但运动显著逆转了 CMECs 的衰老，改善了 CMECs 的血管生成能力。这表明，运动缓解了内皮衰老和功能障碍。
进一步地，实验探讨了线粒体损伤是否与衰老相关的内皮功能障碍有关。在老龄小鼠 CMECs 中观察到堆积的线粒体 ROS 和异常的线粒体膜电位，与久坐的小鼠相比，在运动老龄小鼠的 CMECs 中这些效应被减轻（图2 A、B）。老龄小鼠的 CMECs 在用 FCCP（一种线粒体自噬诱导剂）处理时表现出线粒体自噬受损。衰老导致整体红色 mt-Keima 荧光显著降低（图2 C、D），线粒体 LC3-II 水平降低，p62 水平升高，但这些效应通过运动逆转（图2 E、F）。重要的是，衰老 CMECs 中受损的线粒体自噬是被运动保留（图2 C-F）。老龄小鼠 CMECs 中线粒体自噬受体 FUNDC1 的水平也被证实较低，并且在运动老龄小鼠中恢复其表达（图2 G、H）。这些数据表明，运动减少了衰老 CMECs 的线粒体损伤并恢复了线粒体自噬。
图2 运动可减少衰老CMECs的线粒体损伤并恢复线粒体自噬。
为了验证 FUNDC1 在运动诱导的冠状动脉保护中的作用，实验对 Fundc1fl/Y 和 Fundc1fl/Y/Tek-Cre 小鼠进行为期4周的定期运动训练。结果发现，运动改善 Fundc1fl/Y 小鼠 MI/R 后内皮细胞屏障功能、增强血管新生，改善心脏功能。然后在内皮细胞中过表达 FUNDC1，观察到 FUNDC1 过表达显著降低了 CMECs 中 SA-β-gal 活性，表明过表达的线粒体自噬受体 FUNDC1 逆转了内皮细胞衰老。因此，FUNDC1 过表达改善了 EC 功能，如管形成、迁移和增殖能力。此外，与运动的保护作用一致，FUNDC1 过表达增强了 ACh 刺激的冠状动脉舒张、保护内皮屏障的完整性，恢复了老龄小鼠的 eNOS 磷酸化和 VEGF 表达，并降低了 ET-1 水平。重要的是，AAV-FUNDC1 治疗显著改善了 MI/R 后的心脏收缩功能。这说明，FUNDC1 过表达逆转了内皮衰老和功能障碍。
层流诱导的层流剪切应力（LSS）增加是运动诱导的内皮适应的重要机制。研究者利用层流装置来评估运动过程中 FUNDC1 基因表达的调控机制，并潜在鉴定启动 FUNDC1 转录的转录因子。生物信息学预测表明，FUNDC1 含有 PPARγ 反应元件 （PPRE）（图3 A）。先前的研究表明，层流激活了 ECs 中的 PPARγ。因此，实验评估了层流是否以 PPARγ 依赖性方式增强了 CMECs 中 FUNDC1 基因的表达。ChIP 检测表明，PPARγ 与 CMECs 中的 FUNDC1 启动子区域相互作用（图3 B）。为了验证这一发现，用 PPARγ 特异性拮抗剂 GW9662 预处理 CMECs，并暴露于 20 dyne/cm2 的层流剪切力中持续6小时。在 GW9662 处理下，层流诱导的 LSS 增加了 CMECs PPARγ DNA-结合活性，抑制了流动诱导的 PPARγ 活性（图3 C）。此外，GW9662 显著减弱了 FUNDC1 的表达，但在静态条件下没有，表明 PPARγ 参与剪切力诱导的 FUNDC1 基因表达（图3 D）。此外，与久坐小鼠相比，运动的老年小鼠血管组织中的 PPARγ 表达和活性增强（图3 E、F）。这些数据表明，PPARγ 在 CMECs 中负责层流调控的 FUNDC1 表达。
图3 CMECs中PPARγ与层流增强的FUNDC1基因表达有关。
总之，该研究表明，上调的 FUNDC1 和恢复的线粒体自噬有助于减少衰老过程中运动诱导的内皮衰老和 MI/R 损伤，运动过程中 PPARγ 在调节 FUNDC1 表达中起重要作用。抑制 FUNDC1 本身会导致内皮衰老，并消除运动对内皮细胞和 MI/R 损伤的保护作用。鉴于这些发现，FUNDC1 可能是一个有希望的靶点，用于维持内皮线粒体稳态、防止内皮衰老，并可能通过血管内皮与心脏组织机制的“串扰”减少 MI/R 损伤（图3 G）。
参考文献：Ma L, Li K, Wei W, Zhou J, Li Z, Zhang T, Wangsun Y, Tian F, Dong Q, Zhang H, Xing W. Exercise protects aged mice against coronary endothelial senescence via FUNDC1-dependent mitophagy. Redox Biol. 2023 Jun;62:102693. doi: 10.1016/j.redox.2023.102693. Epub 2023 Apr 1. PMID: 37030149; PMCID: PMC10113862.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37030149/
图片来源：所有图片均来源于参考文献
小编旨在分享、学习、交流生物科学等领域的研究进展。如有侵权或引文不当请联系小编修正。如有任何的想法以及建议，欢迎联系小编。感谢各位的浏览以及关注!进入官网www.naturethink.com或关注"Naturethink"公众号，了解更多相关内容。
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