Q-TOF和生物信息学方法对食品中坚果过敏原综合表征检测详解
食物过敏是一个全球性的健康问题，在过去的几十年里，食物过敏的患病率一直在上升，影响着全球高达10%的儿童[1]，其中IgE介导的食物过敏表现最为常见，如急性荨麻疹、哮喘以及一些危及生命的过敏反应[2]。迄今为止，食物过敏最好的治疗方法就是避免食用致敏食物[3]。中国国家卫生健康委员会(NHC)起草的新版《预包装食品标识通则》(GB7718)中已强制要求对商品中的过敏原进行标识。随着经济的快速发展和全球化，烘焙食品因其独特的口感和营养成分在许多国家越来越受欢迎。出于口味和装饰的目的，面包店通常都会使用牛奶、杏仁、腰果、花生和核桃等成分，这些成分都可能导致成人和儿童过敏[4]。因此，对烘焙食品中隐藏的痕量过敏原的分析方法的需求越来越大。
近日，来自南京市食品药品监督检验院的凌睿院长团队在FOOD QUALITY AND SAFETY（JIF Q1, IF=5.6）期刊上发表了文章“Comprehensive characterization and detection of nut allergens in bakery foods using Q–TOF mass spectrometry and bioinformatics”。本研究展示了一种新的方法，使用液质联用技术同时检测烘焙食品中来自杏仁、腰果、花生和核桃的特异性过敏原。质谱原始数据使用PEAK Studio Xpro软件分析，然后筛选出候选多肽，通过MRM对其热稳性和唯一性进行验证。该方法对烘焙食品中痕量坚果过敏原的鉴定和定量具有一定的指导意义。
优化坚果蛋白的提取与酶切实验条件
首先，为了有效地从原料和烘焙食品样品中提取蛋白质，比较了不同缓冲液的提取效果以及不同酶切时间的影响。如图1所示，缓冲液A (7M尿素，2M硫脲和4% CHAPS)提取坚果样本后的蛋白质浓度明显高于缓冲液B (200 mM Tris−HCl, pH 8.2, 2M尿素)。针对烘焙食品样品，缓冲液C (50 mM Tris-HCl, pH=8.2)比缓冲液D (50 mM NH4HCO3, pH=9.0)更适合。Qi et al., 2019[5]也曾报道过，Tris-HCl缓冲液是烘焙食品中总蛋白提取的合适缓冲体系。如图2所示，12 h消化时间足以产生较好的信号响应。
图1 缓冲液对蛋白提取的影响
图2 酶切时间梯度
候选肽段标志物筛选与MRM靶向验证
杏仁、腰果、花生和核桃蛋白酶切后的肽段在Q-TOF EDR模式下进行DDA数据采集，产生的原始数据使用PEAKS Xpro软件，结合de novo和数据库搜索进行分析。结果，每个坚果样本分别鉴定到155,80,306和177条多肽。基于-10logP打分，每个样本选取Top 30的peptides作为候选多肽，然后通过NCBI植物蛋白质数据库序列比对，排除一般面包店中会使用到的其他常见植物和动物成分的共有序列。最终，共保留了62条长度在11-22个氨基酸之间的多肽用于MRM靶向验证（杏仁18条，腰果13条，花生15条，核桃16条）。在靶向结果中，选取每个坚果中响应信号最强且在其他样本中无鉴定的4条特异性肽段，即共16条，每条肽段3个transitions（见表1）。
表1 四种坚果中发现的特征肽
制备坚果成分添加量分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/kg (mg总蛋白/kg空白基质)的梯度样本，进行特征肽的MRM靶向验证。如图4所示，四种坚果样本中，响应最高的信号肽的标准曲线R2都非常高，并且每条肽段的LOD和LOQ都与文献报道一致[7-9]。另外，在空白基质中分别添加1、5、10 mg/kg的坚果蛋白时，对本分析方法对信号响应Top2的多肽来评估回收率。结果见表3，指定肽段的回收率在72.5% ~ 92.1%之间，相对标准偏差(RSD)小于5.2%。
图4 信号肽标准曲线
表2 特征肽方法学验证结果
表3 肽段回收率测定
在当地面包店购买了商品化的饼干和面包（各5批次）进行上述预处理和分析。结果见表4，除了饼干3和面包1之外，所有样品中都检测到杏仁的存在，但是饼干4、5和面包3、4和5的成分标签上的过敏原信息区域并没有相关标示，在其他三种坚果中也可以注意到类似的现象。对于这一现象，一个可能的原因是交叉污染[10]，因此这些检测结果“阳性”的烘焙食品是可能对消费者的健康构成潜在威胁的，应该引起注意。此外，本研究采用正己烷去除坚果中的脂肪，这一过程也在一定程度上导致了脂溶性过敏原蛋白的损失，这一点有待于在未来的研究中进一步阐明。
表4 商品化面包和饼干特征肽检测结果
本研究建立了一种结合高分辨质谱、生物信息学和三重四极杆质谱的烘焙食品中杏仁、腰果、花生和核桃过敏原的检测方法。该方法检测出了烘焙食品中未标示的过敏原，可作为烘焙食品生产企业的质量控制方法，减少在食品生产过程中无意中添加坚果过敏原的风险，促进产业升级。
参考文献
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