NETRI 3D器官芯片的应用：让芯片中的细胞互做从2D转向“类器官”

近年来，类器官（Organoids）和器官芯片（Organ-on-Chip）技术在生物医学研究中取得了显著进展。类器官作为体外三维细胞培养模型，能够模拟真实器官的结构和功能，广泛应用于疾病建模、药物筛选和再生医学等领域。然而，类器官在培养过程中仍面临着微环境控制不足、重复性差等挑战。与此同时，器官芯片技术通过模拟器官的微环境和生理条件，实现更精准的细胞培养和功能研究。将这两者相结合，能够有效克服各自的局限性，显著提升类器官实验的质量和效率。NETRI团队在类器官（Organoids）与器官芯片（Organ-on-Chip）技术的结合应用上取得了显著的进展。他们通过创新的Duplex Well 3D器官芯片，显著提升了类器官实验的质量和效率。

传统的器官芯片通常基于2D培养细胞模型。这种2D系统中，细胞生长在平面的表面上，尽管它们能在某种程度上模拟人体的细胞反应，但它们通常不能提供与实际器官结构和功能相匹配的环境。随着技术进步，研究者逐渐认识到，3D细胞培养能够更真实地模拟细胞在自然环境中的行为。

3D细胞培养的优势：

• 生理相关性强：3D结构能够提供更真实的细胞间相互作用和细胞外基质（ECM）环境，这些是2D培养无法复制的。
• 细胞生长和分化：在3D环境中，细胞能够更多地接触到周围细胞和基质，促进了细胞的生长、分化和功能表达，尤其对于复杂的多细胞和组织模型尤为重要。
• 模拟复杂的生理状态：例如，血液流动、机械力作用以及细胞代谢等复杂因素，都能在3D模型中得到更好的模拟。

Duplex Well 3D器官芯片功能介绍

多孔膜隔离（Porous Membrane）：

• 多孔膜的作用：孔径为400纳米的多孔膜在设备中起到关键作用，将上下两个池隔开。这样，下方池和上方池之间的物质交换会受到控制（只允许分子物质通过），同时保持一定的物理隔离。对于（eg：肠类器官）和（eg:骨类器官）的共培养，这样的设计可以帮助模拟复杂的生理条件，如不同环境的营养物质或信号分子等物质的交换。
• 孔径：400纳米的孔径适合进行细胞级别的物质交换，同时也可以防止较大物质的跨膜流动，确保实验的精准性。

上方池和下方池设计（图中黄色和蓝色位置）：

• 上方池的功能：容量为142微升，适合放置不同类型的类器官模型。这个池设计支持二维或三维的细胞结构培养，为类器官的生长提供空间。通过此设计，可以在不同的环境中培养（eg：肠类器官）或（eg:骨类器官），控制各自的生长条件。
• 下方池的功能：下方池用于营养物质的灌注和细胞因子的转移。在（eg：肠类器官）和（eg:骨类器官）的共培养中，下方池也可以放置内皮细胞，模拟血管和组织之间的相互作用。

进液口与出液口：

• 进液口：位于左侧，用于引入培养介质、药物或其他成分。
• 出液口：位于右侧，用于排出废物和代谢产物。这个进出水系统使得设备能够持续维持实验条件，并模拟生物体内的物质交换过程。

流体跳线（红色箭头装置）：流体跳线是指在类器官芯片内用于连接不同微流道、实现液体或气体交换的通道。微流控芯片通常由多个微流道组成，这些微流道通过流体跳线相互连接。它们是芯片内流体动力学的核心，确保细胞、营养物质、药物和废物能够在不同区域之间顺利流动。
 

Duplex Well 3D器官芯片

• 轻量版（8个芯片）
• 完整版（16个芯片）

脑类器官构建
背景和研究重点：
类器官的崛起：在过去的十年里，类器官作为一种非常创新的体外模型出现，并且不仅仅限于大脑，还涵盖了多个器官。类器官是一种三维、自组织的细胞结构，具有很大的应用潜力，尤其是在药物发现、神经毒性筛查等领域。

持续存在的问题：

• 再现性差：目前类器官的主要问题是缺乏良好的再现性，即不同实验之间的结果不一致，导致难以复制和验证实验结果。
• 技术的工业化应用困难：将类器官技术从实验室转化到工业规模也存在很大挑战。如何在大规模生产中保持类器官培养的一致性和可重复性是一个关键问题。

解决方案：

• 结合特定设备进行培养：为了克服这些问题，研究人员提出了一种解决方案，即将类器官的培养与他们的设备结合使用。这些设备可以提供非常受控的流体流动，保持细胞微环境的稳定，从而提高类器官培养的再现性。
• 工业兼容性：该方法的一个大优点是与大多数工业化的检测和自动化过程兼容，这使得他们的技术更具前景，特别是在将来应用于大规模生产时。

类器官的应用前景：

• 药物发现和神经毒性筛查：类器官，特别是大脑类器官，正在成为药物发现和神经毒性筛查中的重要工具。类器官能够模拟器官的三维结构和功能，为科学家提供更加贴近生理条件的研究平台。
• 类器官智能化：作者还提到John Hopkinson的研究，他通过结合类器官和人工智能技术，探索类器官在智能化领域的潜力。这种结合使得类器官不仅限于传统的实验平台，还可以进行更为复杂的计算和预测。

使用“duplex well”芯片：

• 芯片设计：研究人员使用一种叫做“duplex well”的高效芯片来解决类器官培养中的问题，并提高其可重复性，同时推动技术的工业化应用。该设备的设计在功能上对解决类器官培养的缺点非常有帮助。

芯片结构：

• 芯片图示：左侧屏幕上显示了芯片的示意图。上面是从上方拍摄的设备图像，展示了类器官在其中的培养情况。下方是免疫染色后的类器官图像，便于观察细胞的形态和分布。
• 双层结构：中间的示意图显示了类器官和其他细胞的布局。虽然图中展示了类器官周围有其他细胞，但此时可以暂时忽略这些细胞，重点关注类器官的培养方式。

类器官的培养方式：

• 开放式和灌流式结构：如Naseeba提到的，芯片的上层是开放式的池，适合3D培养；而底部是灌流式的池，允许培养液流动。这种结构设计非常有利于类器官的生长，因为它既提供了足够的空间支持三维细胞生长，又通过灌流帮助维持良好的培养环境。

膜的特性：

• 不粘附膜：类器官与膜之间的接触较少，类器官不容易粘附在膜上，这对于类器官的培养是非常方便的。这意味着类器官能自由浮动或移动，而不受膜的限制，从而更自然地发展。

培养液流动的作用：

• 培养液流动：底部的培养液流动帮助维持培养环境的动态平衡，避免细胞沉积或培养液的不均匀分布。这种流动有助于提供均匀的营养和氧气供应，从而促进类器官的健康生长。

优化微芯片培养：
研究背景和目标：
1. 实验目的：

• 研究团队的首要目标是通过优化微芯片上的类器官培养，确保大脑类器官的可重复性。团队的工作地点是Statexocepiotec实验室，该实验室隶属于CEA，并且Elo目前正在这里进行博士研究。

实验设计与变量：
1. 实验条件和变量：
研究团队通过调整两大变量来优化类器官培养：

• 胚胎体引入时间点：选择了三个不同的时间点将胚胎体引入设备进行培养，分别是D+2、D+11和D+18。D+2、D+11和D+18代表从胚胎体发育开始的不同时间点，用来观察不同时期引入胚胎体对类器官培养的影响。
• 培养液更换方式：研究团队通过三种不同的方式来更换培养液，这将直接影响细胞的微环境。具体方式如下：

• 底部培养液每两天更换一次。
  顶部培养液每两天更换一次（对于一种条件）。
  顶部培养液每周更换一次（对于另一种条件）。
  顶部培养液完全不更换（作为第三种条件）。

2. 实验目标：

• 研究的重点在于通过观察不同培养液更换策略对微环境的影响，进而确定最佳的培养条件。这些条件的变化将影响类器官的发育，尤其是对胚胎体及类器官周围的微环境的影响。

观察与结论：
微环境变化的影响：

• 研究团队特别强调，通过第三种条件（顶部培养液不更换），营养物质和各种因子只能通过扩散的方式通过膜进入培养环境。这个策略有助于了解在没有频繁更换培养液的情况下，类器官能否维持稳定的发育和生长。
• 微环境的稳定性：通过这种方法，研究团队可以真实地观察微环境稳定性对胚胎体和类器官发育的影响，尤其是长时间不更换培养液是否会影响类器官的发育。

对照组：

• 为了确保实验结果的可靠性，研究团队还使用了传统的24孔板和96孔板作为对照组，与微芯片上的培养条件进行对比。这种对照实验有助于验证微芯片培养条件的有效性和优越性。

这部分内容展示了类器官在培养条件、结构重复性和基因表达方面的良好表现，强调了其在药物筛选和毒理学研究中的潜力。研究团队通过优化培养方法和进一步深入分析，致力于提升类器官模型的可靠性和应用范围，为未来的生物医学研究提供有力支持。

1. 类器官形态及培养条件的可重复性
形态观察：

• 在培养60天后，类器官在所有条件下均成功生长。尽管从图片上不易观察，但实际测量数据显示，类器官在大小上的重复性更高。
• 使用duplex well器官芯片培养的类器官呈现出预期的圆形，没有出现异常形态。

大小分布：
在duplex well器官芯片中培养类器官，大小的重复性显著提高。这对于后续的应用，如神经毒性测试，至关重要。高重复性确保了类器官的表征和预测结果的可靠性，避免因样本差异导致结论的不准确。

2. 类器官的结构及细胞组成
C2架构：

• 在60天培养后，类器官的视觉结构虽然不易观察，但在第三种培养条件下（屏幕最右侧），不同样本间的类器官形态高度相似，优于其他条件，尤其是与24孔板对照组相比。
• 类器官中囊肿（cysts）的出现减少，这是有利的，因为过多的囊肿会影响类器官的功能和稳定性。
• 类器官中存在具有预期形态的玫瑰体（rosettes），且类器官边缘的结构模式组织良好，显示出良好的初步结构形成。

3. 转录水平分析
基因表达：

• 通过RT-QPCR分析了SOX2、CHIP3、BCL2和BACs等基因的表达水平。
• 各培养条件下的基因表达水平与对照组相当，但研究团队仍需进一步深入研究，以确认表达水平的重复性和稳定性。

4. 研究总结与未来方向
研究结论：

• 脑类器官在形态学上可重复地再现了已发表的预期结构，具备正确的细胞类型和良好的空间架构。
• RNA表达水平与对照组相当，显示出类器官在基因表达上的稳定性。
• 目前的重点是提高类器官在大小和空间架构上的重复性，并计划进一步研究细胞类型和基因表达的深入分析。

未来研究方向：

• 研究团队计划将胚胎体（embryonic bodies）置入设备中，并优化培养基的更新方法。
• 下一步会构建血脑屏障（blood-brain barrier）模型，在屏障两侧培养不同类型的细胞，如侧面培养周细胞（pericytes）和星形胶质细胞（astrocytes），底部通道培养脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells）。
• 研究团队认为，类器官在药物筛选和毒理评估方面具有巨大潜力，特别是在神经毒性测试和化合物效果筛查方面，类器官的高重复性为可靠的预测结果提供了保障。

5. 应用前景

• 类器官作为细胞培养模型，能够模拟人体组织的复杂结构和功能，为药物研发和疾病研究提供了更为精准和可靠的平台。
• 通过类器官的高重复性和稳定性，可以进行大规模的药物筛选，减少实验误差，提高研究效率。
• 未来，结合血脑屏障模型，类器官有望在神经科学和脑相关疾病研究中发挥更重要的作用，提供更接近真实生理条件的研究环境。