利用ATP生物发光技术进行类器官药敏活性检测的方法

类器官在药敏药筛这块的活力检测方法采用ATP生物发光技术的方法相对其它方法更简便，更准确。小爱带您了解一下检测方法吧。

1、ATP生物发光技术原理

在类器官细胞培养物中加入相应试剂使类器官裂解，释放ATP，荧光素酶催化底物荧光素的转化，高效利用ATP的能量，发射光子形成光信号。发光强度与ATP在一定范围内成正比，而ATP又与活细胞数目又呈正比，因此可以对类器官活细胞数目进行定量检测。

2、类器官ATP生物发光方法

使用适合进行发光检测的24孔板，每孔接种类器官与基质胶混合物25ul平铺到孔底部，同时设置不含类器官的基质胶与培养液孔作为阴性对照，按照类器官培养的常规方法培养类器官。如有需要，可加入药物处理类器官。此外，如有必要也可以设置类器官的浓度梯度，以便后续确定试剂盒的使用效果。

（2）试剂准备

a. 融化：将ATP活性检测试剂盒置于2~8℃或室温条件下融化；
b. 使用前轻柔颠倒几次使溶液混合均匀。

（3）检测步骤

a. 于培养箱中取出待测类器官培养板，室温放置30min，以使培养板温度平衡至室温；
b. 加入与待测类器官培养物等体积并平衡至室温的缓冲液(abs9730)。例如，使用24孔培养板时，先去除类器官培养基，用类器官缓冲液置换静置清洗3次，然后吸取25μl本品加入25μl待测类器官培养物中（加入体积与基质胶团混合物体积一致）；
c. 剧烈振荡5min使类器官充分裂解；室温放置25min以稳定发光信号，即可进行检测；
d. 使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。请根据仪器要求设置相应的参数，每个孔的检测时间一般为0.25-1s或更长时间，具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整；
e. 根据化学发光读数直接计算类器官的相对活力，或根据ATP标准曲线计算出ATP的量从而计算出类器官细胞的相对活力。类器官在0-30个类器官/孔的类器官密度范围内有良好的线性关系，ATP标准品0-10,000nM浓度范围有良好的线性关系；

注：检测效果因类器官的种类不同而有所不同，对于一些ATP含量特别高的类器官，在类器官数量达到100个后可能会不呈现线性相关，但化学发光读数还是会继续升高的。

（4）ATP 标准曲线的设置（选做）：

把自备的ATP标准溶液用PBS或类器官培养液稀释成适当的浓度梯度。初次检测可以设置0、10、30、100、300、1000、3000、10,000nM这几个浓度，24孔板每孔加入100μl的标准品。如有必要，在后续的实验中可以根据类器官中的ATP含量对标准品的浓度范围进行适当调整。如果用类器官培养液来稀释ATP标准品，稀释后需立即进行后续的发光检测，否则培养液中的ATPase等可以消耗ATP的酶会导致ATP含量下降。