内毒素和核酸酶的检测方法以及对实验的影响

经历过酷暑，大部分城市的气温开始有所下降，外出体感温度有所缓和，在两季交接之际，人们很容易感冒发烧，机体为何会发烧呢？

在免疫系统应对感染、损伤或组织破坏等的即时反应病理过程中，机体内环境中多种物质水平升高，这些物质在体内通过一系列复杂的信号通路，将信号传至大脑体温调节中枢，最终引起体温异常上升，即表现发烧症状。因此发烧是疾病的一个非常重要的指标^[3]。


                                                              热原诱导发热的机制图

能引起恒温动物体温异常升高的物质称为热原，内毒素是最常见的外源性热原。

一、什么是内毒素？

它是革兰阴性菌细胞壁的特殊组分：脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），于细菌死亡解体后大量释放，当全身存在足够数量时，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及弥漫性血管内凝血，多器官衰竭，有时甚至导致人类死亡^[4]。

                                                       LPS引起发热机制图
 

在科研实验中，内毒素也是个不可忽视的因素。

内毒素对不同的细胞会造成不同的影响，主要表现为如下两方面：(1)改变细胞外形，如造成肝细胞外形改变并使变形后的肝细胞吸收六碳糖的能力降低；(2)内毒素在细胞增殖培养过程中引起促进或抑制细胞增殖现象^[2]。

二、耐思产品如何助阵？

国家强制性要求用于人类卫生健康领域的生物医药、医疗器械产品需要检查热原和内毒素含量。

目前列入中国药典的热原检查方法为兔热原检测(RT)法，细菌内毒素检查方法为鲎试验(LT)法（进一步分为两种：凝胶法、光度测定法）。其他检测方法的研究和建立也越来越多，比如酶联免疫吸附测定（ELISA）法、单核细胞活化试验检测法等。


耐思细胞培养和生物工艺解决类产品在万级和十万级洁净车间生产包装，纳入了内毒素检测指标。产品电子束灭菌后对产品进行内毒素鲎试验法检测，严格控制产品内毒素指标，确保产品完美适用于细胞培养。

除内毒素对科研实验中细胞培养有不利影响外，核酸酶也是个不定时炸弹。

一、什么是核酸酶？

核酸酶是所有可以水解破坏核酸的酶类，广泛存在于动植物体内。根据作用底物不同可以将其分为DNA酶（DNase）和RNA酶（RNase）两类。

二、对机体细胞的不利影响

核酸酶在体内一般情况下发挥着重要的生理功能。当体内、外环境存在各种不利因素的影响时，细胞内DNA双链骨架结构不稳定，连接的磷酸二酯键被核酸酶水解，会导致DNA链发生断裂损伤。DNA断裂可阻止RNA合成过程中链延伸或者引起染色质结构变化，可造成转录异常；RNase 对mRNA的异常降解，影响蛋白质表达水平。

这些都会导致表达产物量和质的变化，对细胞功能造成不同程度的影响，甚至导致细胞死亡。

有研究表面，DNase1可加重对乙酰氨基酚引起的小鼠肝细胞坏死^[5]。还有研究表明，DNase介导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依赖性细胞凋亡期间的染色质塌陷，参与凋亡核形态的形成^[6]。


三、耐思产品如何助阵？

耐思产品在万级和十万级洁净车间生产包装，纳入核酸酶检测指标，产品进行qPCR试验验证产品无核酸酶状态，确保产品无核酸酶。

无核酸酶的耐思细胞培养类、生物工艺解决类耗材，可减少细胞培养环境中的有害因素和受损风险，有利于维持其正常的生物学特性和功能，从而有利于细胞实验研究或活性蛋白的生产。同时也减少实验的干扰因素，确保研究结果的准确性。


                                    耐思细胞学类和生物工艺解决类耗材

核酸分子检测类产品，应用目的为样品中核酸的定性和定量检测，检测过程和环境中不得含有破坏核酸的物质。耐思PCR类耗材无核酸酶污染，确保其核酸检测结果的准确可靠。

                                                      耐思PCR耗材

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参考资料：

[1] 步宏，李一雷.病理学[M] .9版.北京：人民卫生出版社，2018

[2] 孙巍群，陈锦阳，刘军权. 临床用细胞培养实验室质量控制[J]. 中华临床实验室管理电子杂志. 2019 年 8 月 第 7 卷 第 3 期

[3] N Prajitha, S Athira, P Mohanan. Pyrogens, a polypeptide produces fever by metabolic changes in hypothalamus: Mechanisms and detections[J]. Immunology Letters, Volume 204, December 2018, Pages 38-46.

[4] P.E. Boucher. Chapter 22 - A Framework for Evaluating Nonclinical Safety of Novel Adjuvants and Adjuvanted Preventive Vaccines. Immunopotentiators in Modern Vaccines (Second Edition), 2017, Pages 445-476.

[5] Markus Napirei, Alexei G. Basnakian, Eugene O. Apostolov, Hans Georg Mannherz. Deoxyribonuclease 1 aggravates acetaminophen‐induced liver necrosis in male CD‐1 mice[J]. Liver Biology and Pathobiology, First published: 26 January 2006.

[6] Victoria Iglesias-Guimarais, Estel Gil-Guiñon, María Sánchez-Osuna, Mercè García-Belinchón, Joan X. Comella, Victor J. Yuste. Chromatin Collapse during Caspase-dependent Apoptotic Cell Death Requires DNA Fragmentation Factor, 40-kDa Subunit-/Caspase-activated Deoxyribonuclease-mediated 3′-OH Single-strand DNA Breaks[J]. CELL BIOLOGY, Volume 288, Issue 13, P9200-9215, March 2013.