用 FDA二乙酸荧光素和 PI碘化丙啶对细胞球状体进行活力染色操作手册

前言

基于荧光染色的细胞活力检测法可用于评估哺乳动物细胞的活力。同时使用两种荧光染料可以对活细胞群和死细胞群进行双色区分。在本应用指南中，我们介绍了一种使用二乙酸荧光素（FDA）和碘化丙啶（PI）的染色方案，它们可分别对存活细胞和死亡细胞进行染色。染色方案适用于贴壁细胞、嵌入细胞外基质的单细胞和3D细胞簇，例如细胞球状体。

实验原理

在生物学研究中，FDA（二乙酸荧光素）和PI（碘化丙啶）被用作活/死细胞的染色剂。FDA 能够被细胞吸收，并在酯酶的作用下，无荧光的 FDA 可被转化为带绿色荧光的代谢物荧光素。这种转化过程可以作为细胞活力的指标，因为它依赖于活细胞内的酯酶活性。

与之相对，PI 作为一种细胞核染色染料，它无法穿越活细胞的完整细胞膜。然而，当细胞死亡时，其细胞膜的结构会发生变化，PI能够通过这些无序的区域进入细胞核，并与 DNA 双螺旋结构结合。

实验材料与设备

• 二乙酸荧光素（FDA）

将 5 mg FDA 溶解在 1 mL 丙酮中，配制得 FDA 储存液（储存液需 -20 °C 保存）

• 碘化丙啶

将 2 mg PI 溶于 1 mL PBS（ 4 °C 储存），配制得 PI 原液。

• 不含胎牛血清的细胞培养基

• 磷酸盐缓冲液或其他缓冲液

• 带 Texas Red 和 FITC 滤片的倒置荧光显微镜

 

染色步骤

为确保实验结果的准确性，染色体系应即配即用，且其有效使用时间应严格控制在 2 h 以内。在非使用时段，为确保染色体系的稳定性和有效性，应将其避光保存，并置于 4°C 恒温条件下进行保存。

图 1：二乙酸荧光素/碘化丙啶染色体系

针对单个细胞的染色步骤

对于粘附在培养表面或嵌入细胞外基质中的单细胞，建议采用以下染色方案：

1. 根据图1所示之配方，准确配制染色体系，并将其存放在 4 ℃ 冰箱中冷藏；
2. 将细胞离心后弃上清（去除细胞培养基）；
3. 加入染色体系——其体积应基于所用载玻片或培养皿的尺寸和规格确定（请参考相应的产品规格说明）；
4. 在室温下避光孵育细胞 4~5 min；
5. 将细胞离心后弃上清（去除染色体系）；
6. 用适量磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗样本，以去除残留的染色体系；
7. 加入 PBS 或不含胎牛血清的培养基；
8. 使用荧光显微镜观察细胞。

针对 3D 细胞培养的染色步骤

以下方案适用于 3D 细胞培养，如细胞球状体、组织等：

1. 根据图1所示之配方，准确配制染色体系，并将其存放在 4 ℃ 冰箱中冷藏；

2. 收集细胞团；如有必要，将细胞培养体系离心后弃上清，以收集细胞团；

3. 离心后弃上清；

4. 精确加入 1 mL 染色体系；

5. 在室温下避光孵育细胞 4~5 min；

6. 将细胞离心后弃上清（去除染色体系）；

7. 用适量磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗样本，以去除残留的染色体系；

8. 加入 PBS 或不含胎牛血清的培养基；

9. 将细胞团转移至 ibidi µ-Slide 8 孔腔室载玻片中（ibidi, 80826）；

10. 使用荧光显微镜观察细胞。

    

    ibidi, 80826

常见实验问题

1.信号弱

针对信号弱的问题，建议根据实验的具体情况调整染料浓度或延长孵育时间。同时，务必确保染色液的使用时间不超过两小时，以保持其活性。另外，建议将染色液储存于 4°C 的避光环境中。

2.背景信号高

高背景信号可能由培养基成分引起，这些成分可能干扰荧光信号的检测。为确保实验的准确性，推荐使用不含血清的培养基。另外，可尝试使用无酚红培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）作为替代。在除去染色液后，增加额外的清洗步骤有助于降低背景信号的干扰。

3.光漂白效应

荧光信号可能因光漂白效应而随时间减弱。因此，快速操作对于保持实验条件的一致性和可重复性至关重要。在处理大量样品时，建议分批次进行染色，每次仅处理有限数量的样品。为确保细胞的最佳生长条件，建议使用 ibidi 载物台培养箱进行培养。

ibidi 载物台培养箱
 

应用示例

1.对单个细胞进行染色
贴壁细胞系 MDA-MB-231 的活力染色显示细胞活力很高（从左到右：相差显微镜镜检（明场）图像、示 PI 信号图像、示 FDA 信号图像、FDA 和 PI 信号的叠加场图像）比例尺：200 μm。
对包埋在胶原基质胶中的 Jurkat 细胞进行活力染色，结果显示细胞活力为 65%。(A：相差显微镜镜检（明场）图像；B：示 PI 信号图像；C：示 FDA 信号图像；D：FDA 和 PI 信号的叠加场图像）比例尺：200 μm。

2.对细胞球状体进行染色

MCF-7 细胞球状体的活力染色（从左到右：相差显微镜镜检（明场）图像、示 PI 信号、示 FDA 信号、FDA 和 PI 信号的叠加场图像）比例尺：200 μm。
 

MCF-7 细胞球状体的共聚焦激光扫描显微镜图像显示了球状体的内部结构：坏死的中心被一层有活力的细胞包围（从左到右：示 PI 信号图像、示 FDA 信号图像、FDA 和 PI 信号的叠加场图像）。标尺：200 μm

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