小胶质细胞AAV突变体在开发高效感染小胶质细胞的病毒载体工具的应用
目前可通过敲入基因的手段实现对小胶质细胞的标记，通过病毒载体工具实现对小胶质细胞的特异性操纵。基于病毒的基因传递系统的两个主要组成部分是：首先由结构蛋白和酶组成的包装元件，合成病毒；其次，在细胞类型特异性启动子下驱动的编码感兴趣基因的转移载体。
早期利用2型和6型腺相关病毒AAV为载体， F4/80和 CD68为启动子实现特异性标记小胶质细胞，但是感染细胞的效率低、存在部分脱靶、引起组织免疫反应等问题。
2022年7月25日北京生命科学研究所罗敏敏林睿团队开发了高效、便捷、一体化操纵小胶质细胞的AAV病毒载体工具，极大促进小胶质细胞的功能研究。
1、 体内外高效感染小胶质细胞的AAV病毒突变体
研究人员通过体外实验通过随机插入氨基酸序列引起突变，筛选了能够实现较高转染小胶质细胞效率的衣壳蛋白AAV-cMG.QRP (~55%) 和AAV-cMG.WPP (~75%)。相比之下，AAV5衣壳蛋白感染效率不到12%, AAV9衣壳蛋白感染效率不到10%,转染效率最高的AAV8也只到34%。
为了实现更高的感染效率，他们对AAV-cMG.QRP和AAV-cMG.WPP进行突变筛选，通过体外实验发现在 594-596 位包含PAD氨基酸序列的AAV-cMG.QRP突变体（AAV-cMG），能够达到86%的感染效率。
通过Cx3cr1-cre工具小鼠在体筛选了在587–589氨基酸序列两个AAV-cMG.WPP突变体AAV-MG1.1 和 AAV-MG1.2，这两种突变体包装的AAV病毒能够在体感染80%以上的小胶质细胞，而且不引起小胶质细胞的激活。
图1：高效感染小胶质细胞的AAV-MG1.1和 AAV-MG1.2
2、感染小胶质细胞的AAV病毒突变体多应用场景
将AAV-MG1.2包装成钙离子指示剂注射到Cx3cr1-cre工具小鼠体感皮层后，腹腔注射脂多糖刺激后可明显观察到体感皮层小胶质细胞胞体钙离子信号的增加。这就表明AAV-MG1.2可用于追踪小胶质细胞活性变化。
将AAV-MG1.2包装成ATP荧光探针注射到Cx3cr1-cre工具小鼠体感皮层后，在脂多糖刺激2小时后可小胶质细胞胞体ATP荧光增加达到高峰，这一增加可持续6小时。这就表明AAV-MG1.2可用于追踪小胶质细胞胞外ATP水平变化。
进一步利用AAV-MG1.2表达Cas9系统在向导RNA靶向嘌呤能受体基因P2ry12后可实现特异性敲除小胶质细胞的P2ry12。在敲除P2ry12后，小胶质细胞不能快速募集到组织损伤的部位，表明小胶质细胞功能受损。这就表明AAV-MG1.2可用于基因编辑小胶质细胞的功能基因。
总结
本文开发了能够高效感染小胶质细胞的AAV突变体AAV-MG1.1 and AAV-MG1.2，利用这些突变体携带不同的功能基团可实现标记、观察小胶质细胞和敲除特异性表达在小胶质细胞的基因，为小胶质细胞的功能研究提供了“利器”。
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