甲氨蝶呤在扰动流下通过抑制 YAP/TAZ 对动脉粥样硬化的保护作用
几项研究表明，长期低剂量甲氨蝶呤（MTX）治疗类风湿性关节炎与降低心血管疾病和心血管死亡率有关。MTX 增加一磷酸腺苷（AMP）和5-氨基咪唑-4-羧基酰胺核糖核苷酸（AICAR）的细胞内积累，从而激活 AMP 活化蛋白激酶（AMPK）。AMPK 在促进 YAP Ser127 位点磷酸化中发挥作用，使 YAP 磷酸化以诱导其细胞质定位和蛋白酶体降解，因此，AMPK 的激活导致 YAP 磷酸化和失活。
基于此，在哈尔滨医科大学附属第二医院心内科、心外科以及附属心肌缺血教育部重点实验室的一项研究中，假设 AMPK 通路介导 YAP/TAZ 功能失活和 MTX 的动脉粥样硬化保护作用，实验评估了 MTX 对动脉粥样硬化保护作用的贡献以及对 DF 保护作用的背后信号机制。文章名为《Atheroprotective effects of methotrexate via the inhibition of YAP/TAZ under disturbed flow》。
HUVECs中YAP/TAZ激活和核定位的血流动力学调节
为了研究 YAP/TAZ 在不同剪切力下 HUVECs 中的作用，将培养的 HUVECs 暴露于单向剪切应力（USS）12 dyn/cm2、扰流（DF） 0 ± 4 dyn/cm2 或静态条件（STA）下 10 小时。通过蛋白质印迹测量了 p-YAP（Ser127）、总 YAP/TAZ 和粘附分子的蛋白质表达水平。结果表明，DF 导致 p-YAP（Ser127）显著降低和 ICAM1、VCAM1 和 TAZ 表达显著增加。IF 染色显示 DF 导致 YAP/TAZ 核定位，而在接受 USS 的 HUVECs 中观察到增加的 YAP/TAZ 细胞质保留。此外，还通过 IF 检测了 YAP 磷酸化水平，发现DF显著降低p-YAP。
DF促进了YAP/TAZ的转录活性并显著增加了YAP/TAZ靶基因CYR61和CTGF的表达。相反，USS 增强了 p-YAP并降低了 YAP/TAZ 靶基因表达。此外，生物力学拉伸介导 HUVECs 募集单核细胞的能力。使用细胞粘附测定，发现在 DF 下附着在 HUVECs 上的 THP1 单核细胞数量增加，这伴随着粘附分子的上调。
这些结果表明，DF 导致 YAP 去磷酸化和激活，而 USS 导致 YAP 磷酸化和失活。
MTX 磷酸化 AMPK 并减轻 DF 诱导的 HUVECs 中促炎细胞因子的表达
用 MTX（0-100 nM）处理 HUVECs，48 小时后通过蛋白质印迹定量 p-AMPK 水平。结果表明，在静态条件下培养的 HUVECs 中的 p-AMPK 以剂量依赖性方式增加，最大水平为 100 nM时。该浓度与患者血浆的常规治疗低剂量剂量一致。
为了确定 MTX 是否在血流动力学作用下改变促炎细胞因子的表达，使用 qRT-PCR 分析促炎细胞因子基因和 YAP/TAZ 靶基因的水平。在 DF 下观察到更高水平的IL-6、IL-8、CYR61和CTGF，而不是在 HUVECs 中的 USS，并且 MTX 处理显著抑制了它们的表达。
为了确定低剂量 MTX 是否诱导 AMPK 下游的变化，检测了不同流动条件下 p-YAP（Ser127）的蛋白质表达水平。结果表明，DF而非USS导致YAP磷酸化显著降低。然而，当在 USS 下比较 MTX 处理与对照效果时，没有观察到 YAP 磷酸化的显著变化。MTX处理导致DF或STA下p-YAP表达显著增加，后者导致MTX处理后p-YAP表达更高。
MTX 抑制 DF 诱导的 YAP/TAZ 活化并发挥动脉粥样硬化保护作用，而沉默 AMPKα 可逆转这些作用
接下来探讨了 MTX 是否在生物力学拉伸下介导 HUVECs 中的 YAP/TAZ 失活。蛋白质印迹分析显示，DF 下 MTX 显著上调 p-YAP 和 p-AMPK 的表达，并显著降低 ICAM1 和 VCAM1 的水平。还观察到总 YAP 在细胞质中以高水平组成性表达，并且在 DF 下 MTX（100 nM）处理后单核细胞粘附减少。这些数据表明 MTX 介导 YAP 抑制并减少单核细胞-HUVEC 相互作用，至少部分有助于抗动脉粥样硬化作用。
因为 YAP 可以被 AMPK 磷酸化，于是进一步探讨了 AMPK 在这种 MTX 诱导的保护作用中的作用，并确定 MTX 介导的 YAP 磷酸化是否依赖于 AMPK。siRNA 耗尽 AMPKα促进了 YAP 核转位，几乎消除了 MTX 介导的 YAP 磷酸化和 p-YAP 细胞质定位，表明 AMPK 在介导 MTX 诱导的YAP 失活中的关键作用。在 HUVECs 中敲低 AMPK 后，DF 下单核细胞粘附蛋白的水平和单核细胞粘附均显著增加。
沉默 YAP 会降低 DF 下的粘附分子表达
为了进一步证实 YAP 和 DF 诱导的促炎反应之间的关联，针对 YAP 的 siRNA 被用来检查 YAP、粘附分子和 AMPK 之间的相互作用。蛋白质印迹结果表明，敲除 YAP 显著抑制 ICAM1 和 VCAM1 的表达，但不改变 DF 下的 p-AMPK 蛋白水平，表明 AMPK 作用于 YAP 上游，并且 YAP 耗竭可能导致动脉粥样硬化。
MTX对DF诱导的细胞凋亡和YAP磷酸化的影响
受损的内皮功能包括动脉粥样硬化的早期阶段。实验采用流式细胞仪检测 DF 下的细胞凋亡。与 STA 相比，DF 而不是 USS 的应用显著增加了总细胞凋亡率。然而，用 MTX 治疗并没有减少细胞凋亡。
使用蛋白质印迹分析，检测到在 DF 下用 MTX 和广泛使用的动脉粥样硬化药物阿托伐他汀处理的 HUVECs 中 p-YAP 表达水平相当。结果表明，在 MTX（100 nM）或阿托伐他汀（1 μM）存在下细胞暴露于 DF 会导致 YAP 过度磷酸化。MTX和他汀类药物治疗之间的p-YAP表达水平没有统计学上的显著差异。
MTX 治疗可减少体内 DF 诱导的斑块形成
为了确定低剂量 MTX 在体内的潜在抗动脉硬化作用，在左颈总动脉周围放置了一个铸型以诱导 DF。在暴露于西式饮食 4 周后，在 DF 区域出现了明显的动脉粥样硬化病变。YAP/TAZ 染色在动脉粥样硬化切片的内膜、中层和内膜增生斑块中显著。相反，用MTX治疗小鼠导致动脉粥样硬化斑块和YAP/TAZ的相对表达显著减少。此外，DF 区域的管腔大于 0.9% 盐水处理的管腔。
总之，得出结论，MTX 通过 AMP 依赖性激酶（AMPK）-YAP/TAZ 通路发挥保护作用。从治疗的角度来看，这些发现提供了对 MTX 赋予动脉粥样硬化保护机制的见解，并可能有助于开发新的治疗方法来限制动脉粥样硬化。
参考文献：Liu D, Lv H, Liu Q, Sun Y, Hou S, Zhang L, Yang M, Han B, Wang G, Wang X, Du W, Nie H, Zhang R, Huang X, Hou J, Yu B. Atheroprotective effects of methotrexate via the inhibition of YAP/TAZ under disturbed flow. J Transl Med. 2019 Nov 15;17(1):378. doi: 10.1186/s12967-019-02135-8. PMID: 31730006; PMCID: PMC6857284.
文章来源：http://www.naturethink.com/?news/237.html
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