干细胞污染防控技术
在干细胞的基础与应用研究飞速发展的今天, 干细胞的体外培养和实际应用中可能出现的安全问题越来越受关注。相对于干细胞内源性污染，外源性污染防控更重要。本文介绍一种如何控制外源性污染的方法。
干细胞是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的细胞, 是构成机体所有功能细胞的种子细胞 ,在体外适宜的培养条件下可以无限增殖, 进而分化为多种功能细胞及组织器官。当代科学家普遍认为, 人类干细胞的研究将为再生医学提供广阔的应用前景 。特别是在组
织工程学方面,干细胞被认为可以解决长期困扰临床的器官不足和免疫排斥的难题, 从而实现人类用人工培养的组织和器官替代或更换疾病组织和器官的目标。
干细胞研究及其相关临床应用在为人类带来巨大利益的同时 ,也存在着生物危害的潜在安全隐患。例如 ,无论用于基础研究还是临床治疗 ,都必须经过实验室干细胞分离 、培养 、定向诱导分化甚至基因操作, 体内研究还涉及细胞的移植和体内示踪等较为复杂和耗时的过程 ,在干细胞实验室操作中 ,存在来自干细胞的内源性的和操作过程中外源性的生物危害风险。
一 内源性污染
1 内源性污染的来源
内源性污染主要是从干细胞的来源来考虑的 。目前, 在干细胞的基础研究和临床治疗研究中 ,首要来源是自体干细胞;其次是异体干细胞 ;此外 , 还有经过特殊培养的动物来源的干细胞等 。所谓干细胞的内源性污染,着重强调的是细胞自身所携带传染性疾病以及遗传性疾病的问题。
二 外源性污染
1 外源性污染的来源
外源性污染 ,通常是指外源性微生物污染 ,包括细菌、支原体 、真菌和病毒污染等。细菌感染较为多见的是大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌、假单胞菌属等 ;常见的支原体污染包括以下几种:人源支原体通常由实验人员带入 (如口腔支原体 、人支原体、唾液支原体);动物来源的支原体通常经牛血清带入 (发酵支原体 、精氨酸支原体 、莱氏支原体 );猪鼻支原体(分离自猪)可能经胰蛋白酶 (在分离 、消化细胞时使用)带入。
外源性污染可能的途径有:①细胞分离和处理过程。细胞在操作和储存的过程中面临着严峻的细菌和支原体污染威胁 。病毒污染有可能是细胞实验中偶然带入病毒 ,如利用病毒建立细胞系或者利用病毒诱导编码目的蛋白基因的表达, 使用被病毒污染的生物制品如动物血清组分 、胰蛋白酶等,在操作过程被实验人员携带病毒污染。 ②许多干细胞的长期培养需要动物 (如小鼠 )基质细胞作为饲养细胞来支持生长 ,导致一些已知或未知的动物源性病原体污染 。多年的体外细胞培养 、骨髓细胞移植及组织器官移植等经验告诉我们, 微生物污染处处存在。因此 ,在细胞实验中以及实验前后 ,对微生物污染进行严格的检测显得尤为重要。
2.外源性污染的危害
与内源性污染相比 ,外源性污染具有污染途径多、防控更为复杂的特点 。所以, 是否能够在每个环节严格把关,防止外源性污染的发生,保证干细胞的质量 ,对于干细胞研究和临床治疗研究起着决定性作用 。如果外源性污染控制不力 ,除了加重病情 ,预期临床治疗失败以外 ,污染的病毒如果整合到受体的 DNA内 ,甚至可能导致肿瘤的意外发生。
三 外源性污染的防控措施
相对于内源性污染防控 ,外源性污染的防控更加重要，重在加强实验室的操作规范。
1. 规范干细胞风险评估体系
为了完善干细胞操作的风险评估体系 , 首要任务是建立一个各种类型干细胞模型的操作分级标准 ，详细备案分离、增殖 、分化各种来源干细胞的操作步骤和实验方案, 这有助于对微生物污染的来源 (人、试剂、器材等 )进行判断。
2. 建立系统的病原微生物检测方法
细菌的检测首先通过观察细胞培养上清的颜色变化, 当发生细菌污染时 ,短期内培养液颜色变黄 ,表明有大量酸性物质产生 ,有时可出现明显混浊现象;其次在倒置显微镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮,有时在细胞表面和周围有大量细菌存在 ,细胞生长停止并有中毒表现 ;也可通过培养液涂片染色检查初步确定细菌种类 ;或者通过肉汤培养基增菌培养予以鉴定 。
四．一种来自欧盟的干细胞实验室控制方案
干细胞研究中的安全问题技术性很强, 也许我们永远无法彻底消除其不同层面、不同来源的安全性隐患。从防控角度来讲，外源性的污染要比内源性的更加重要，那么有没有一种有效防控外源性污染的方法呢？一种来自欧盟的实验室方式，欧菲姆电源式过氧化氢空间干雾灭菌系统有效解决这一问题。
1. 设备原理
电源式干雾灭菌系统是使用电源带动（无须使用压缩空气），利用文丘里原理高速吸入空气，在喷头内给空气足够大的动能。让气体高速与消毒液碰撞产生直径小于5微米的干雾颗粒。让消毒液以干雾颗粒的形式弥散在需要灭菌的无菌洁净区，从而达到彻底灭菌效果，可替代熏蒸。原理非常简单，但是需要解决：瞬间提供空气足够高的动能让颗粒达到均匀的3－5微米、散热降噪、设备空间占用三大问题。而欧菲姆独有的硼钴合金自带润滑功能的器械喷头设计，将干雾设备的功效扩大化的同时，极大的降低了空间占用，解决了散热，降噪的问题。
2 干雾灭菌方案构成
诺福特效杀孢子剂 + 欧菲姆干雾灭菌设备
干雾灭菌方案可安全用于P2以上级别的：无菌实验室、微生物室环境消毒灭菌。
诺福特效杀孢子剂的特点：
①杀菌效力广谱高效：同时杀灭200多种微生物。30分钟对黑色枯草芽孢、嗜热脂肪芽孢杆菌均能稳定达到6个对单位杀灭率。
②欧盟进口，无味、无毒，对人体、环境安全。欧盟医疗食品安全认证。
③验证资料齐全：可提供杀菌效力验证；残留验证；材料兼容性验证三项验证的详细资料，可提供验证模版。
3.欧菲姆干雾灭菌设备的特点
①全球领先的雾化技术。干雾微粒均匀达到3－5微米。面积完全覆盖。杀菌时间超短，1.5-3个小时可完成整个灭菌流程，保证实验室空间安全。
②体积小、重量轻（净重5.8KG），可方便使用大空间洁净区（多点布置），和小空间无菌室灭菌。电源连接，方便移动。
结论：干细胞实验室，外源性的污染防控比内源性污染更复杂，一种来自欧盟的技术，能有效减少外源风险。 建议在风险评估研究和技术革新的基础上, 制定和完善我国干细胞和细胞研究生物安全管理的体系和法律法规 ,有效保证我国干细胞研究与应用的健康发展。
干细胞是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的细胞, 是构成机体所有功能细胞的种子细胞 ,在体外适宜的培养条件下可以无限增殖, 进而分化为多种功能细胞及组织器官。当代科学家普遍认为, 人类干细胞的研究将为再生医学提供广阔的应用前景 。特别是在组
织工程学方面,干细胞被认为可以解决长期困扰临床的器官不足和免疫排斥的难题, 从而实现人类用人工培养的组织和器官替代或更换疾病组织和器官的目标。
干细胞研究及其相关临床应用在为人类带来巨大利益的同时 ,也存在着生物危害的潜在安全隐患。例如 ,无论用于基础研究还是临床治疗 ,都必须经过实验室干细胞分离 、培养 、定向诱导分化甚至基因操作, 体内研究还涉及细胞的移植和体内示踪等较为复杂和耗时的过程 ,在干细胞实验室操作中 ,存在来自干细胞的内源性的和操作过程中外源性的生物危害风险。
一 内源性污染
1 内源性污染的来源
内源性污染主要是从干细胞的来源来考虑的 。目前, 在干细胞的基础研究和临床治疗研究中 ,首要来源是自体干细胞;其次是异体干细胞 ;此外 , 还有经过特殊培养的动物来源的干细胞等 。所谓干细胞的内源性污染,着重强调的是细胞自身所携带传染性疾病以及遗传性疾病的问题。
二 外源性污染
1 外源性污染的来源
外源性污染 ,通常是指外源性微生物污染 ,包括细菌、支原体 、真菌和病毒污染等。细菌感染较为多见的是大肠杆菌 、金黄色葡萄球菌、假单胞菌属等 ;常见的支原体污染包括以下几种:人源支原体通常由实验人员带入 (如口腔支原体 、人支原体、唾液支原体);动物来源的支原体通常经牛血清带入 (发酵支原体 、精氨酸支原体 、莱氏支原体 );猪鼻支原体(分离自猪)可能经胰蛋白酶 (在分离 、消化细胞时使用)带入。
外源性污染可能的途径有:①细胞分离和处理过程。细胞在操作和储存的过程中面临着严峻的细菌和支原体污染威胁 。病毒污染有可能是细胞实验中偶然带入病毒 ,如利用病毒建立细胞系或者利用病毒诱导编码目的蛋白基因的表达, 使用被病毒污染的生物制品如动物血清组分 、胰蛋白酶等,在操作过程被实验人员携带病毒污染。 ②许多干细胞的长期培养需要动物 (如小鼠 )基质细胞作为饲养细胞来支持生长 ,导致一些已知或未知的动物源性病原体污染 。多年的体外细胞培养 、骨髓细胞移植及组织器官移植等经验告诉我们, 微生物污染处处存在。因此 ,在细胞实验中以及实验前后 ,对微生物污染进行严格的检测显得尤为重要。
2.外源性污染的危害
与内源性污染相比 ,外源性污染具有污染途径多、防控更为复杂的特点 。所以, 是否能够在每个环节严格把关,防止外源性污染的发生,保证干细胞的质量 ,对于干细胞研究和临床治疗研究起着决定性作用 。如果外源性污染控制不力 ,除了加重病情 ,预期临床治疗失败以外 ,污染的病毒如果整合到受体的 DNA内 ,甚至可能导致肿瘤的意外发生。
三 外源性污染的防控措施
相对于内源性污染防控 ,外源性污染的防控更加重要，重在加强实验室的操作规范。
1. 规范干细胞风险评估体系
为了完善干细胞操作的风险评估体系 , 首要任务是建立一个各种类型干细胞模型的操作分级标准 ，详细备案分离、增殖 、分化各种来源干细胞的操作步骤和实验方案, 这有助于对微生物污染的来源 (人、试剂、器材等 )进行判断。
2. 建立系统的病原微生物检测方法
细菌的检测首先通过观察细胞培养上清的颜色变化, 当发生细菌污染时 ,短期内培养液颜色变黄 ,表明有大量酸性物质产生 ,有时可出现明显混浊现象;其次在倒置显微镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮,有时在细胞表面和周围有大量细菌存在 ,细胞生长停止并有中毒表现 ;也可通过培养液涂片染色检查初步确定细菌种类 ;或者通过肉汤培养基增菌培养予以鉴定 。
四．一种来自欧盟的干细胞实验室控制方案
干细胞研究中的安全问题技术性很强, 也许我们永远无法彻底消除其不同层面、不同来源的安全性隐患。从防控角度来讲，外源性的污染要比内源性的更加重要，那么有没有一种有效防控外源性污染的方法呢？一种来自欧盟的实验室方式，欧菲姆电源式过氧化氢空间干雾灭菌系统有效解决这一问题。
1. 设备原理
电源式干雾灭菌系统是使用电源带动（无须使用压缩空气），利用文丘里原理高速吸入空气，在喷头内给空气足够大的动能。让气体高速与消毒液碰撞产生直径小于5微米的干雾颗粒。让消毒液以干雾颗粒的形式弥散在需要灭菌的无菌洁净区，从而达到彻底灭菌效果，可替代熏蒸。原理非常简单，但是需要解决：瞬间提供空气足够高的动能让颗粒达到均匀的3－5微米、散热降噪、设备空间占用三大问题。而欧菲姆独有的硼钴合金自带润滑功能的器械喷头设计，将干雾设备的功效扩大化的同时，极大的降低了空间占用，解决了散热，降噪的问题。
2 干雾灭菌方案构成
诺福特效杀孢子剂 + 欧菲姆干雾灭菌设备
干雾灭菌方案可安全用于P2以上级别的：无菌实验室、微生物室环境消毒灭菌。
诺福特效杀孢子剂的特点：
①杀菌效力广谱高效：同时杀灭200多种微生物。30分钟对黑色枯草芽孢、嗜热脂肪芽孢杆菌均能稳定达到6个对单位杀灭率。
②欧盟进口，无味、无毒，对人体、环境安全。欧盟医疗食品安全认证。
③验证资料齐全：可提供杀菌效力验证；残留验证；材料兼容性验证三项验证的详细资料，可提供验证模版。
3.欧菲姆干雾灭菌设备的特点
①全球领先的雾化技术。干雾微粒均匀达到3－5微米。面积完全覆盖。杀菌时间超短，1.5-3个小时可完成整个灭菌流程，保证实验室空间安全。
②体积小、重量轻（净重5.8KG），可方便使用大空间洁净区（多点布置），和小空间无菌室灭菌。电源连接，方便移动。
结论：干细胞实验室，外源性的污染防控比内源性污染更复杂，一种来自欧盟的技术，能有效减少外源风险。 建议在风险评估研究和技术革新的基础上, 制定和完善我国干细胞和细胞研究生物安全管理的体系和法律法规 ,有效保证我国干细胞研究与应用的健康发展。
