荧光纳米探针在生命科学成像中的应用
纳米材料“点亮”生命科学
—荧光纳米探针的生物成像应用
本文作者：Dr. Jessy
从罗伯特虎克自制镜筒下的小隔间般的植物细胞，到下村修实验室中翠色荧荧的水母蛋白，再到庄小威显示屏上晦明倏烁的染料分子对，我们从未停下用光学成像探索生命微观世界的脚步。而同样作为二十一世纪产业革命的中流砥柱的纳米技术，在材料科学的赛道上蓬勃发展至今，终于与生命科学碰撞产生了新的火花—荧光纳米探针，用纳米材料的光，点亮生命微观世界。
1、引 言
荧光（fluorescent），是一种光致发光的自然发光现象。
自然中的荧光现象不胜枚举，而从发光水母中提取的绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP），是自然给予我们探索微观生命世界的第一个火种。将绿色荧光蛋白的基因导入其他生命体内表达，就可以使原本不具备自然荧光性质的生物也能产生绿色荧光。科学家通过解析GFP的结构及发光原理等研究，进一步提升了其颜色种类、光强、稳定性等性质，极大地推动了荧光蛋白在生物成像中的应用。
虽然荧光蛋白家族日益壮大，但是在应用范围上仍然有所局限，此外，荧光蛋白的发射光谱较宽且不规则，多色同步成像时易发生串色。通过与化学合成的碰撞，有机荧光染料顺势而生，其品类丰富、操作简单，不但极大地扩展了荧光成像的应用范围，还方便进行标准商业化生产，为荧光成像的大发展奠定了扎实的基础。
图1. (a)量子点结构示意图及CdSe/ZnS量子点吸收、发射光谱图[1]。
(b)上转换纳米探针示意图[2]及980nm激发下不同掺杂比例的NaLuF4溶液发光图像[3]。
但有机染料仍然不是荧光成像的最佳拍档，其荧光效率低、光稳定性差等缺点，都是阻碍荧光成像发展的绊脚石。
在此同时，纳米技术也在材料领域如火如荼地掀起新一轮技术革命，纳米材料自身特殊的光学特性、可定向合成组装等优点，均为荧光成像注入了全新的血液。
目前常见荧光纳米材料有半导体量子点(Quantum dots, QDs)、上转换稀土材料(Upconversion nanoparticles, UCNPs)、金属纳米粒子等。与其他染料相比，荧光纳米材料具有量子产率高、稳定性强、斯托克斯位移大、激发光谱宽而发射光谱窄等优点，且可以通过尺寸调节发射波长，通过组装修饰提高其生物相容性、丰富识别传感等功能，是未来荧光标记的最佳选择之一。
2、荧光纳米探针基本工作流程
作为纳米化学与生物成像的交叉结合位点，荧光纳米探针的工程流程与传统的生物成像的有所不同，是个涵盖理论计算、化学合成、生物成像，甚至医学检测等多学科多领域的长链过程。
图2. 荧光纳米探针基本工作流程
首先，荧光纳米探针的研究过程大多为应用导向的，根据具体的生物应用需求设计具有特殊光学性质或其他功能的纳米材料（如近红外、上转换、双光子等），然后进行纳米材料的合成与表征，筛选出高质量的纳米材料。
随后，再进一步考虑探针的生物相容性或光控、载药、识别等功能性的需求，对探针进行修饰组装。最后，在荧光纳米探针的生物成像阶段，往往会从体外细胞到体内组织/细胞，最终应用于活体动态成像，或进一步服务于医疗诊断研究。
光学显微镜在荧光纳米探针的研究中的应用，大多集中在纳米材料的表征筛选和探针的生物成像应用两个部分。在材料的表征筛选阶段，由于纳米材料具有内在的结构异质性，个体性质往往具有很大的个体差异性。与传统的检测大量粒子整体性质的方法相比，光学显微镜可在单粒子水平筛选出高质量探针，并进一步研究其构效关系，指导纳米材料的设计以改善其性能。而在生物成像阶段，光学显微镜则可以可在单粒子水平检测纳米探针的光学信号，实现对其时空动态变化过程的成像追踪。
3. 荧光纳米探针典型应用及显微镜解决方案
3.1 近红外/上转换探针 -FV3000近红外成像解决方案近红外成像由于具有穿透深、光毒性小、组织自发光干扰小等优点，成为现今光学成像的研究热点。
而荧光纳米探针如量子点，可以通过调节化学组成及形貌尺寸，轻松实现近红外激发。此外，上转换纳米材料具有受长波长(近红外)的光激发时，可发射比激发光波长更短的光(可见光或者紫外光)的特殊光学性质，被认为是新一代荧光生物标记材料之一，有望在生物医药、能源催化等领域发挥重要的作用。
在体肝毒性的灵敏实时检测是目前药物性肝损伤诊断的难点。中国药科大学天然药物国家重点实验室的李会军教授课题组2020年在Nanoscale发表的A sensitive upconverting nanoprobe based on signal amplification technology for real-time in situ monitoring of drug-induced liver injury研究论文中，设计了一种由上转换纳米粒子(upconversion nanoparticles, UCNPs)和金纳米棒(gold nanorods, GNR)组装的上转换纳米探针，并将其用应用于药物肝损伤的原位实时诊断。
这种新型的纳米探针可在肝脏内聚集并被肝脏损伤标志物——miR122特异性激活，在980nm近红外光激发下产生800nm的荧光成像，结合发光共振能量转移（luminescence resonance energy transfer, LRET）效应和信号放大技术，进一步提高其检测灵敏度，可实现对miR122的高灵敏检测，为药物肝损伤的临床实时监测提供了新的思路[4]。
使用Olympus FV3000拍摄的 miR122过表达(OE)及敲除(KD)的HL7702 细胞的上转换发光图像[4]。
与常规共聚焦成像相比，近红外/上转换纳米探针成像需满足以下技术要求：
1、常规共聚焦显微镜的激发波长大多在400-650nm之间，而近红外成像需要>700nm波长的近红外激光器。2、常规成像光路部件如扫描振镜、物镜、光栅等大都只在可见光范围进行增透/校准，无法保证近红外成像效率及准确度
3、近红外检测需要>750nm近红外专用检测器。
面对以上需求，Olympus FV3000激光共聚焦显微镜提供了成熟系统的近红外成像解决方案，致力于高灵敏、更准确多色的近红外成像。
此外，FV3000还可拓展ANALOG单元，将外部电压信号记录为图像数据与扫描图像同步。还可将扫描时间信号传送到外部设备，通过BNC端口轻松实现与第三方外部设备的联用，轻松实现荧光信号与电化学信号、FLIM等多模态检测信号的同步。
3.2 肿瘤标记物在体成像 -FVMPE-RS活体深层检测方案
癌症已成为世界最严重的公共健康问题之一，对恶性肿瘤的早期诊断及准确切除也已成为目前医学研究的重中之重。
而通过设计开发新型荧光纳米探针，实现对肿瘤标记物的特异性识别、高分辨在体成像，可以为恶性肿瘤的早期临床诊断以及外科准确切除提供新的检测方案。肿瘤细胞中的酶如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）的过度表达是肿瘤发生、发展和恶化的重要临床指标，因此对碱性磷酸酶活性的灵敏快速检测有助于肿瘤的早期发现和准确切除。
大连理工大学精细化工国家重点实验 彭孝军 院士 团队2020年在Angew. Chem. Int. Ed.（德国应用化学）发表的An Activatable AIEgen Probe for High-Fidelity Monitoring of Overexpressed Tumor Enzyme Activity and Its Application to Surgical Tumor Excision的研究成果中，设计制备了一种用于碱性磷酸酶（ALP）活性成像的AIEgen探针（DQM-ALP）。
这种探针具有聚集诱导发光性质，与肿瘤细胞过表达的碱性磷酸酶作用后会聚集产生强荧光，克服了常规有机染料容易聚集荧光淬灭的缺点，在进一步提高检测灵敏度的同时也提高了探针在肿瘤细胞的滞留时间。
该工作首次监测到了丁酸钠和皮质醇刺激对肿瘤细胞碱性磷酸酶活性的上调作用，并通过双光子显微镜实现了对HeLa和HepG-2肿瘤球体中碱性磷酸酶活性的高空间分辨率三维深层成像，证明了该探针可应用于亚毫米级肿瘤的荧光检测成像，为肿瘤的临床诊断和手术切除提供了有力的辅助工具[5]。
图4. DQM-ALP AIEgen探针组装应用示意图。
DQM-ALP探针标记Hela多细胞肿瘤球体单/双光子荧光图像。
以上研究中使用了Olympus多款单/双光子共聚焦显微镜，而最新 FVMPE-RS双光子显微镜，专为活体深层荧光成像设计，独家的高速扫描振镜和高灵敏检测光路，可在更准确高效地实现对肿瘤标记物的高分辨率三维深层成像。
而双谱线/双激光以及最多四通道高灵敏检测器的专业配置，可以更灵活地进行多色同步成像，进一步提高检测的通量及效率。此外，独立于成像的同步光刺激模块，可在时间和空间上完美实现飞秒激光对样品的精确空间光刺激及信号的同步快速采集，是光控、光动力等特殊纳米探针检测的不二之选。
3.3 活细胞探针动态检测 –SpinSR快速超分辨解决方案
活细胞中的生物化学反应等分子事件往往具有显著的时空动态特性，通过光学成像技术可精确追踪纳米探针的运动轨迹，研究其与生物分子的相互作用，可有效监测其动态变化，并进一步探究其状态与相关细胞功能的关系。内体、溶酶体等细胞器在信号转导、维持代谢平衡等方面发挥着关键作用，由于这些细胞器在内吞过程中pH会发生变化，因此对这些细胞器pH值的快速灵敏检测成为动态监测内吞过程、探究其状态与功能关系等研究的重点。
北京大学汪贻广教授、德克萨斯大学西南医学中心Gao Jinming教授团队2016年在Advanced Materies发表的Digitization of Endocytic pH by Hybrid Ultra-pH-Sensitive Nanoprobes at Single-Organelle Resolution论文中，设计了一种单细胞器分辨率的pH超灵敏纳米探针 (HyUPS)，用于追踪检测内吞过程中内体/溶酶体等细胞器的pH变化。
该探针含有三种pH敏感的组分，对应内吞过程的三种组分及三个pH范围，并分别使用红绿蓝三种荧光团标记。该探针成功实现了活细胞内吞相关细胞器酸化速率的动态多色实时监测，为研究内体/溶酶体功能障碍疾病的进一步研究提供了新的成像工具[6]。
图5. HyUPS纳米探针检测受体介导的肿瘤细胞内吞过程中细胞器pH变化示意图。
使用转盘共聚焦显微镜对Hela细胞中单个HyUPS纳米探针标记的内吞细胞器实时动态追踪荧光图像[6]。
对活细胞探针的成像需要借助高速成像设备，而传统的点扫描共聚焦难以满足这类实验要求。Olympus SpinSR转盘共聚焦超高分辨成像系统，轻松实现多色超高分辨（110nm）快速（200fps）成像，适合捕捉精细结构的快速动态过程，堪称生命科学研究者轻松提高成像效率的利器。独有的RTCe（Real Time Controller）控制各部件同步工作，最大限度降低激发光对样品的影响，配合专为深层活组织成像设计的硅油物镜，更适合对活细胞、细胞球及类器官等样品进行长时间深层准确成像。
近十几年来, 随着纳米技术和光学成像技术的飞速发展, 基于荧光纳米探针的生物化学成像应用已取得了许多重要进展。但是，荧光纳米探针在应用上仍然受制于其生物相容性、存在荧光闪烁行为等不足。随着纳米材料、生物成像以及化学合成、理论物理、图像分析等学科的不断发展、交流、融合，可望进一步提高荧光纳米探针生物成像的特异性、准确性、稳定性和重现性, 使之在更多领域发挥更重要的作用。
参考文献：
[1]. Liu S., Wang Z, Xie H, Liu A, Pang D. Single-Virus Tracking: From Imaging Methodologies to Virological Applications[J]. Chemical Reviews, 2020, 120(3).
[2]. Chang H, Xie J, Zhao B, Liu B, Xu S, Ren N, Xie X, Huang L, Huang W. Rare Earth Ion-Doped Upconversion Nanocrystals: Synthesis and Surface Modification[J]. Nanomaterials, 2014, 5(1):1-25.
[3]. Chen Z, Wu X, Hu S, Hu P, Liu Y. Multicolor upconversion NaLuF4 fluorescent nanoprobe for plant cell imaging and detection of sodium fluorescein[J]. J. Mater. Chem. C, 2015, 3, 153-161
[4]. Meng L, Zheng X, Zheng Z, Zhao Z, Wang L, Zhou P, Xin G, Li P, Li H. A sensitive upconverting nanoprobe based on signal amplification technology for real-time in situ monitoring of drug-induced liver injury. Nanoscale. 2020 Jul 23;12(28):15325-15335.
[5]. Li H, Yao Q, Xu F, Li Y, Kim D, Chung J, Baek G, Wu X, Hillman P, Lee E, Ge H, Fan J, Wang J, Nam S, Peng X, Yoon J, An Activatable AIEgen Probe for High-Fidelity Monitoring of Overexpressed Tumor Enzyme Activity and Its Application to Surgical Tumor Excision. Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 10186.
[6]. Wang, Y., Wang, C., Li, Y., Huang, G., Zhao, T., Ma, X., Wang, Z., Sumer, B. D., White, M. A., Gao, J., Digitization of Endocytic pH by Hybrid Ultra‐pH‐Sensitive Nanoprobes at Single‐Organelle Resolution. Adv. Mater. 2017, 29, 1603794.
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