p62介导的人内皮细胞与巨噬细胞共培养条件下的自噬

内皮功能障碍作为一种病理状态，被认为是动脉粥样硬化进展中的一个关键事件。动脉壁中的脂质积累是动脉粥样硬化的明确特征之一，血管内壁的内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化斑块形成的早期事件。

自噬是一种保守的细胞过程，可降解和回收受损的细胞内聚集体和细胞器。自噬过程伴随巨噬细胞的增加。在人类中，自噬通过极化线粒体和阻止细胞色素c的释放，也为动脉粥样硬化斑块的细胞提供了一种保护，以对抗细胞氧化应激。动脉粥样硬化进展的特征是自噬受损。据报道，在动脉粥样硬化期间，各种机制涉及自噬受损或自噬相关的分子变化。

众所周知的自噬受体 p62/SQSTM1 (p62) 在细胞的选择性自噬和细胞抗氧化反应中发挥重要作用。由于p62将包括脂质在内的细胞内自噬物质运输到自噬体进行降解，自噬的破坏会导致 p62 积累。p62水平升高通常被认为是自噬活性受到抑制的标志。

有两种主要的细胞内降解系统：泛素-蛋白酶体系统（UPS）和自噬-溶酶体系统。这些系统在检测和去除错误折叠蛋白方面发挥着重要的监视作用。由于 p62 作为一个桥梁，蛋白酶体抑制可以激活自噬。由于泛素化是可逆的，它在自噬中具有双向作用，泛素化也及时参与调节自噬。

尽管有报道称在受损细胞条件下p62水平升高表明自噬缺陷，但人们认为p62的积累可能是一种适应不良或细胞保护反应，尤其是在动脉粥样硬化中。基于此，来自韩国尚志大学医学院、延世大学医学院神经科系、京畿大学生命科学系等的专家学者进行了深入研究，旨在阐明在动脉粥样硬化条件下 p62 介导的自噬在人内皮细胞 (ECs ) 中的作用。相关研究成果发表在 International Journal Molecular Sciences 题为《P62 Links the Autophagy Pathway and the Ubiquitin–Proteasome System in Endothelial Cells during Atherosclerosis》。

实验结果：

oxLDL 在共培养的 HUVEC 和 THP-1 细胞中诱导先天免疫反应和炎症

为了模拟动脉粥样硬化条件下的血管状况，共培养人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 和人单核细胞 THP-1 细胞，并用氧化低密度脂蛋白 (oxLDL、50 µg/mL) 处理 6、12、24 或 48 小时。然后从共培养物中收集上清液并使用 ELISA 测量 C1q 的水平，C1q 是一种先天免疫分子，是补体系统的经典途径的一部分。

在oxLDL处理后24小时，C1q仍在增加，但没有进一步增加 (图1 A)。接下来，从共培养物中分离出的细胞裂解液在蛋白质水平上进行分析。值得注意的是，HUVECs 中的 C1q 蛋白水平与分泌的 C1q 水平相似 (图1 B)。

此外，还分析了 oxLDL作用下THP-1细胞中被裂解的IL-1β蛋白水平，发现oxLDL处理后24小时，IL-1β被裂解最高，48小时时略有下降 (图1 C)。采用BODIPY对HUVECs和THP-1细胞进行染色，研究oxLDL处理后各细胞的脂质沉积情况。在共培养的 HUVECs 和 THP-1 细胞中，在 0、6 和 24 小时检测到 oxLDL 处理后的脂质负荷，脂质积累在 24 小时而不是在 6 小时时显著增加 (图1 D)。
 

图 1  oxLDL 在共培养的巨噬细胞和内皮细胞上的暴露

自噬被诱导但在动脉粥样硬化条件下发生功能障碍

首先，检测共培养中HUVECs 和 THP-1 细胞的自噬水平。自噬阳性 HUVECs 的数量在 oxLDL 暴露后 8 h 显著增加，在 24 h 达到峰值，然后在 48 h 下降 (图2 A)。在THP-1细胞中，自噬阳性细胞的数量在8 h时增加，但在48 h后仍保持在较高水平 (图2 B)。

然而，这项研究主要集中在暴露于oxLDL的动脉粥样硬化条件下受损的HUVECs。如图1 D所示，确定脂质被加载到HUVECs中，从而研究了自噬在清除 HUVECs 中沉积的脂质中的作用。通过蛋白质印迹分析了 HUVECs 中自噬相关蛋白Beclin1 、p62、LC3-II 的水平 (图2 D)。

结果表明，与 THP-1 细胞相比，beclin-1 和 p62 蛋白水平均呈时间依赖性增加，但略有延迟。此外，在 oxLDL 暴露 24 小时后，LC3-II 的水平增加，但在 48 小时后下降。此外，溶酶体关联膜蛋白2 (LAMP2) 蛋白水平逆转为 p62 蛋白水平。出乎意料的是，在暴露于 oxLDL 后，LAMP2 的水平以时间依赖性方式降低。
 

图 2  oxLDL暴露时共培养巨噬细胞和内皮细胞的自噬启动

下调 p62 诱导替代降解系统

为了更好地了解自噬和自噬受损在动脉粥样硬化条件下的作用，在 oxLDL 暴露前，p62被siRNA沉默48小时。因此，当与 oxLDL 共培养 24 小时时，siRNA处理的HUVECs中p62 mRNA 和蛋白水平均下调。长期暴露于oxLDL可损害内皮细胞的自噬。

THP-1与HUVECs共培养时，沉默p62, HUVECs中的LC3-II降低，负载的脂质相应增加。同样，代表自噬执行的 LC3 阳性水平受到 p62 下调和蛋白酶体系统抑制剂的阻碍。与 LC3 相反，oxLDL暴露降低了LAMP2 mRNA水平，p62的下调没有显著改变LAMP2 mRNA水平。然而，LAMP2 的蛋白质水平因 p62 下调而升高。此外，siRNA-p62 处理的 HUVECs 中 LAMP2 阳性信号略有增强，足以克服 oxLDL 损伤。

E3 连接酶参与动脉粥样硬化条件下的自噬

通过qPCR在mRNA水平检测E3连接酶的变化。Cul4 是 CRL E3 连接酶家族的成员，在oxLDL暴露于HUVECs后24 h表达增加，48 h表达减少 (图3 B)。此外，在 p62 沉默的 HUVECs 中 mRNA 水平降低。另一种 E3 连接酶 NEDD4 是 HECT E3 连接酶的一个组成部分，其 mRNA 水平在oxLDL处理或p62敲低时没有变化 (图3 C)。

为了进一步阐明自噬和蛋白酶体泛素系统在清除致动脉粥样硬化物质中的作用，将 p62-siRNA、MG132（蛋白酶体抑制剂）、heclin（HECT E3 连接酶抑制剂）和 MLN4924（CRL E3 连接酶抑制剂）注入暴露于oxLDL的细胞中 (图3 D)。通过沉默 p62，与 si 对照处理的 HUVECs 相比，多聚泛素化蛋白FK2 检测到的多泛素化蛋白是丰富的。相反，用 MG132 和 MLN4924 处理减少了多泛素化蛋白，但用 HECT E3 连接酶抑制剂 Heclin 处理没有改变 (图3 D)。
 

图 3  E3 连接酶参与自噬

实验结论：

总的来说，这项研究探索了p62介导的人内皮细胞与巨噬细胞共培养条件下的自噬。暴露于 oxLDL 后，脂质在 ECs 中积累并诱导自噬，但在长期暴露于 oxLDL 后未能降解。细胞内脂质过多会导致溶酶体功能障碍，蛋白酶体系统可以帮助缓解这一问题。

这项研究证明了在动脉粥样硬化条件下溶酶体和蛋白酶体降解之间的相互作用，而未来也需要进一步研究 E3 连接酶抑制剂的靶点、每种 E3 连接酶的作用以及特定的 E3 连接酶与自噬相关分子之间的相互调节机制。

参考文献：Kim S, Lee W, Cho K. P62 Links the Autophagy Pathway and the Ubiquitin-Proteasome System in Endothelial Cells during Atherosclerosis. Int J Mol Sci. 2021 Jul 21;22(15):7791. doi: 10.3390/ijms22157791. PMID: 34360560; PMCID: PMC8346161.

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