自噬在牙齿移动过程中的作用
正畸牙移动(OTM)是在牙周韧带(PDL)和牙槽骨特异性位点重塑的压力作用下发生的。一般来说，正畸治疗对支持组织有积极的影响。然而，它可能导致有害的牙周反应，包括牙槽骨和软组织结构的丧失，这可能对口腔康复构成相当大的挑战。
压力在直接和间接调节破骨细胞的骨稳态中起着至关重要的作用。据报道，压力可以直接参与破骨细胞的生成。压力还可以通过一些其他细胞（如 PDL 细胞）释放的分子运输作用于破骨细胞。PDL 细胞在 OTM 中受到压力，释放各种活性细胞因子，包括骨保护素 (OPG) 和核因子-κB 配体受体激活剂 (RANKL)，来影响破骨细胞以调节 OTM 过程。
自噬是一种进化上保守的物理分子过程，可降解细胞中不需要的或功能失调的细胞器。因此，自噬被认为是一种保护细胞存活和维持细胞稳态的机制。自噬通常以低水平发生在细胞中，以维持细胞器内环境的平衡，但在某些压力条件下会上调。自噬在多种细胞中增加，例如人乳腺癌细胞系、软骨细胞、椎间盘源性髓核细胞，以响应压力作用。
早期的电子显微镜研究显示，在 OTM 期间，位于正畸牙压力侧的 PDL 细胞中的自噬增加。此外，之前的研究还发现，自噬通过 RANKL 和 OPG 信号通路对骨质矿化和骨内稳态产生深远影响。然而，自噬对 OTM 期间组织响应压力反应的贡献仍不清楚。
基于此，由上海同济大学口腔医学院正畸科、上海牙组织修复与再生工程技术研究中心的专家学者进行了合作研究，试图探讨PDL细胞是否通过压力诱导的自噬来调节OTM过程中破骨细胞的生成。相关研究成果发表在 Journal of Periodontology 题为《Compressive force-induced autophagy in periodontal ligament cells downregulates osteoclastogenesis during tooth movement》。
实验结果：
正畸力诱导PDL中的自噬
为了研究正畸力是否诱导自噬，建立了一个OTM模型（图1 A）。正畸力侧自噬关键蛋白LC3II/I和Beclin-1的表达水平高于对照组（图1 B）。此外，实验组中自噬标志物Atg5、Atg12、Atg8/LC3 mRNA表达水平也高于对照组（图1 C）。免疫荧光染色进一步证实，施加正畸力后PDL细胞 LC3B和Beclin-1水平显著升高（图1 D、E）。
图 1 在正畸力作用下，PDL 组织中的自噬增加
压力调节PDL细胞中的自噬表达
为了确认PDL细胞是否激活了自噬，对PDL细胞施加压力。首先，对 PDL 细胞施加 1.5 g/cm2的压力作用 3、6、9、12 和 24 h 后，LC3II/I 和 Beclin-1 的表达水平在 3、6 和 9h时升高（图2 B）。自噬标志物Atg5、Atg12和Atg8/LC3的mRNA表达水平也遵循类似的模式（图2 C）。
然后，对 PDL 细胞施加 1.5、3.0 和 4.5 g/cm2的压力作用 6 h后，LC3II/I 和 Beclin-1 的表达水平在 1.5 g/cm2压力下显著升高（图2 D)。自噬标志物Atg5和Atg8/LC3的mRNA表达水平也遵循类似的模式（图2 E）。
为了确定细胞自噬通量，取PDL细胞前用50µM氯喹处理4小时。压力诱导的p62蛋白的表达减少，LC3II / I蛋白的表达增加，而用氯喹处理则诱导p62和LC3II/I蛋白的积累（图2 F）。
接下来，用 mRFP-GFP-LC3 腺病毒处理 PDL 细胞。在 1.5 g/cm2压力后，每个细胞的 mRFP 阳性自噬体和双阳性自噬体的数量均显著增加（图2 G）。
在这项研究中，TEM 还用于确认压力对自噬体和自噬溶酶体形成的影响。实验发现，在1.5 g/cm2的压力作用6小时后，PDL细胞胞质中自噬体和自噬溶酶体的数量更高（图2 H）。
这些结果表明，PDL细胞在压力和响应轻压力作用下出现早期自噬。
图 2 PDL 细胞中压力诱导的自噬
自噬抑制 OTM，增加骨密度
为了探索自噬在 OTM 过程中的作用，向动物注射自噬抑制剂 3-MA 或自噬启动子雷帕霉素。蛋白质印迹结果表明，在OTM模型中，3-MA可下调牙周组织的自噬，雷帕霉素可上调自噬。在 OTM 动物中观察到牙齿移动距离增加。3-MA+ OTM 组的距离显著大于 OTM 组。这表明自噬可以抑制OTM，并增加骨密度。
正畸力后自噬抑制破骨细胞生成
接下来进一步研究自噬如何影响破骨细胞生成，这两者都直接参与牙齿移动过程中的骨重塑。向 OTM 动物注射 3-MA 和雷帕霉素，并观察到在 3-MA 处理的 OTM 动物中 PDL 压力侧结构完整性丧失。然而，雷帕霉素的施用保护了 PDL 组织免受结构完整性的损失（图3 A）。
与对照侧相比，在OTM侧，TRAP染色表明注射雷帕霉素显著减少了破骨细胞的数量（图3 B)。RT-PCR 显示，在 OTM 期间，用 3-MA 处理的细胞中破骨细胞相关因子 CTSK、基质金属蛋白酶-9、TRAP 和 RANKL/OPG 的 mRNA 表达水平显著升高。与此相反，雷帕霉素下调了破骨细胞的活性（图3 C）。
这些结果共同证明，自噬抑制了 OTM 中的破骨细胞的生成。
图 3 自噬抑制 PDL 组织中破骨细胞的表达
压力诱导的自噬抑制 RANKL/OPG 系统
为了进一步研究 PDL 细胞中自噬如何抑制破骨细胞活性的机制，实验检测了 RANKL/OPG 的表达水平。首先，研究了在压力作用下RANKL / OPG的表达，发现其比例显著增加，在6h时达到最高水平，然后下降（图4 A、B）。
为了研究自噬对 RANKL/OPG 表达的影响，将 3-MA 和雷帕霉素注入 PDL 细胞，蛋白质印迹结果显示 3-MA 下调 PDL 细胞的自噬，雷帕霉素上调自噬（图4 C）。
然后，使用 ELISA 来测试培养的PDL细胞经6小时力加载后上清液中RANKL和OPG的蛋白水平。结果表明，在压力作用6小时后，RANKL/OPG比值增加，而且在压力下PDL细胞中3-MA进一步增加了该比值 (图4 D)。
通过RT-PCR进一步发现，在1.5 g/cm2压力作用6h下，PDL细胞中3-MA显著上调，雷帕霉素显著下调RANKL/OPG比值 (图4 E)，这表明自噬可能通过自分泌和旁分泌机制调节 RANKL 和 OPG 表达之间的平衡，来负调控破骨细胞生成。
图 4 自噬对 PDL 细胞中 RANKL 和 OPG 表达的影响
实验结论：
PDL 细胞中的自噬在压力作用下被激活，并通过抑制 RANKL/OPG 系统来调节破骨细胞活性。这项研究提供了第一个科学证据，表明自噬在牙齿移动过程中起作用。
这些发现增加了我们对牙齿移动过程中发生的动力学变化背后的生物机制的理解。此外，从研究中获得的知识可能有助于未来设计新的治疗方法。
参考文献：Chen L, Mo S, Hua Y. Compressive force-induced autophagy in periodontal ligament cells downregulates osteoclastogenesis during tooth movement. J Periodontol. 2019 Oct;90(10):1170-1181. doi: 10.1002/JPER.19-0049. Epub 2019 Jun 2. PMID: 31077358.
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