流动刺激独立于初级纤毛的人肾近端小管芯片中的药物转运
肾脏芯片或肾脏微流控技术的最新进展显示，通过概括体内组织特征，在肾脏疾病建模和药物诱导性肾损伤 (DIKI) 评估方面具有巨大的潜力。三维 (3D) 肾脏模型，从微流体装置到生物打印近端小管，在流动下培养肾细胞并与细胞外基质 (ECM) 结合，推进体外建模。这种模型也引起了人们的兴趣，用于临床前药物安全性评估，以改进药物开发早期阶段的 DIKI 预测。
尽管 DIKI 已被描述为肾单位的所有部分，但药物主要影响近端小管上皮细胞 (PTECs)，因为该段细胞中存在的膜转运蛋白主动分泌许多外源性物质，这增加了细胞的暴露。大多数肾脏药物转运蛋白研究是在传统的二维静态细胞培养中进行的，尽管最近这也在 3D 肾脏模型中得到了解决。
流体剪切应力 (FSS) 已被证明对于改善3D 肾脏模型中的体外生物活性和细胞形态很重要。PTECs 在顶端暴露于脉动流中，脉动流是由心脏的泵血作用和肾内血流动力学控制产生，导致肾小球滤过，从而引起 FSS ，这会影响肾细胞的细胞骨架组织。此外，已证明 FSS 刺激了 PTECs 的极化，并在体内发现将其转化为柱状形态。将 PTECs 暴露于 FSS 导致白蛋白摄取和 P-gp 活性增加，以及通过OCT2 和 MATE1 的协同作用介导的有机阳离子跨细胞转运增加。
PTECs向更接近体内形态的这种转变归因于FSS, FSS被微绒毛、糖萼和存在于顶端膜的初级纤毛感知。在流动下培养时，初级集合管细胞和肾脏类器官中的初级纤毛数量增多。
去年，来自荷兰拉德堡德大学药理学和毒理学系、人类遗传学系，德国弗莱堡大学医学院儿科和青少年医学中心等单位的专家对此领域进行了合作研究，于 Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 发表了题为《Flow stimulates drug transport in a human kidney proximal tubule-on-a-chip independent of primary cilia》的研究成果。
这项研究旨在阐明 FSS 在人类条件永生化PTEC亲本 (ciPTEC-parent) 中药物转运活性、白蛋白摄取和上皮细胞形态方面的作用，并将其与微流控3 D装置 （OrganoPlate）中初级纤毛敲除的ciPTEC系进行比较，评估这是否通过初级纤毛介导的信号传导。
实验方法：
ciPTEC-parent在OrganoPlate 中培养，然后施加生理峰值为 2.0 dyne/cm2 或低峰值为 0.5 dyne/cm2 的 FSS。在 FSS 暴露 9 天后，测定白蛋白- FITC 摄取、p -糖蛋白 (P-gp) 和多药耐药相关蛋白2/4 (MRP2/4) 的活性、细胞毒性和细胞形态。
图 1
实验结果：
流体剪切应力诱导白蛋白摄取和 P-gp 活性增加
首先，在正常或低流量培养的ciPTEC-parent 中评估MRP2/4和P-gp的白蛋白摄取和外排活性（图2 A）。用白蛋白-FITCC测定cubilin- 和 megalin- 介导的白蛋白摄取（图2 A），在正常流量下与BSA(10 mg/mL)共孵育时，cubilin- 和 megalin- 介导的白蛋白摄取降低了0.65 ± 0.04倍 (图2B) 。当 ciPTEC-parent在正常流量下培养时 ，与低流量（图2 B）相比，白蛋白摄取增加，与BSA共孵育时，白蛋白摄取消失 (图2B)。
P-gp活性的测定采用基于钙黄绿素-AM的类似的方法，它可以在细胞内自由扩散，是P-gp的底物。与 CsA（30 μM）（一种已知的 P-gp 抑制剂）共同孵育后，与正常和低流量条件相比，钙黄绿素的积累分别增加了 3.8 ± 0.4 倍和 2.9 ± 0.7 倍（图2 D)。同样，与正常和低流量条件相比，暴露于 P-gp 模型抑制剂 PSC833 (5 μM) 后，观察到钙黄绿素的积累分别增加了 2.9 ± 0.3 倍和 2.6 ± 0.5 倍（图 2 D)。与低流量相比，在正常流量下和与PSC833共孵育时，钙黄绿素-AM 流出显著增强，表明在正常流量下，在ciPTEC-parent 中P-gp活性增强（图2 D）。然而，这种增加的外排在暴露于 CsA 时并不显著。
图 2
MRP2/4 和 P-gp 的白蛋白摄取和转运活性在初级纤毛敲除模型中不受影响
接下来，实验研究了正常血流中增加的白蛋白摄取和 P-gp 活性是否可以通过初级纤毛介导的对 FSS 的反应来解释。因此，在正常和低流量培养时，测量了cubilin- 和megalin-介导的白蛋白摄取以及外排转运蛋白MRP2/4和P-gp的活性 (图3 A)。
在正常流量下，白蛋白-FITC 摄取（0.74 ± 0.04 倍）在与 BSA 共孵育后降低（图3 B）。与 ciPTEC-parent一致， 与低流量（图3 B）相比，对照组在正常流量下观察到白蛋白-FITC 摄取显著增加，但与BSA共孵育时没有。
MRP2 / 4活性在暴露于PSC833，MK571和Ko143后受到抑制，与正常和低流量对照，GS-MF积累分别增加3.0 ± 0.3倍和2.4 ± 0.6倍（图3 C ）。与 ciPTEC-parent 相似，GS-MF在正常流动中比在低流动中明显增加 (图3 C)，但在对照组和抑制组没有显著差异。
在与 CsA 或 PSC833 孵育后，钙黄绿素的积累量分别比正常流量下增加3.5 ± 0.3倍和3.4 ± 0.4倍（图3 D）。此外，在低流量条件下，与 CsA 或 PSC833 孵育后，与对照组相比，钙黄绿素的保留量分别增加了 2.8 ± 1.0 倍和 2.2 ± 0.7 倍（图3 D）。
图 3
FSS 诱导的 PTEC 细胞形态变化
在ciPTEC-parent 和ciPTEC-KIF3α−/−中的钙黄绿素染色的单细胞膜中测量细胞表面积、纵横比和圆形度。在流动条件和细胞系中观察到不同的细胞密度。在正常流动条件下，在 ciPTEC-parent 和ciPTEC-KIF3α−/−中培养时，细胞表面积均减少。此外，在正常流动条件下，细胞伸长与轴流方向一致，这与两种细胞系的更高的纵横比和ciPTEC-parent细胞的圆度降低有关。
对环孢霉素A （CsA）的细胞毒性反应与正常流量下 P-gp 活性的增强无关
CsA是一种已知的肾毒性物质，据报道可引起内质网(ER)和线粒体的损伤，并增加PTECs的氧化应激。由于 P-gp 活性较低，CsA 诱导的细胞毒性在低流量下可能更严重，因此，实验在24 h的流动条件和细胞系中研究了CsA (30 μM) 的细胞毒性反应（图 4）。
在 ciPTEC-parent 中（图4 A），在正常 (94 ± 1%) 和低流量 (95 ± 1%) 条件下暴露于 CsA 后，细胞活力降低。尽管在ciPTEC-parent 中发现P-gp活性在低流量时降低，但这并不导致CsA 诱导的细胞毒性增加（图4 A）。有趣的是，与 ciPTEC-parent 相比，ciPTEC-KIF3α -/-对 CsA 诱导的细胞毒性更敏感，无论流量如何（图4 B)，当暴露于正常或低流量（均为71 ± 4%）时，导致细胞活力降低。这表明初级纤毛的相关机制，不是由流动触发的，而是涉及更敏感的 ciPTEC-KIF3α -/- 表型。
图 4
实验结论：
该研究首次证明 FSS 诱导的 PTEC 白蛋白摄取增加、药物外排和表型延长与初级纤毛无关。实验在 OrganoPlate观察到，在生理相关的脉动 FSS 下培养永生化 PTECs 时，白蛋白摄取、P-gp 活性和表型形态变化显著增加。通过消耗 KIF3α 基因建立了一个没有初级纤毛的细胞系，该基因的体内突变体与囊肿的形成有关，囊肿是一种严重的肾脏疾病。
总之，该研究的意义在于证明了FSS 诱导的PTECs生物学特性和活性的改善不是通过初级纤毛相关机制介导的。
参考文献：Vriend J, Peters JGP, Nieskens TTG, Škovroňová R, Blaimschein N, Schmidts M, Roepman R, Schirris TJJ, Russel FGM, Masereeuw R, Wilmer MJ. Flow stimulates drug transport in a human kidney proximal tubule-on-a-chip independent of primary cilia. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2020 Jan;1864(1):129433. doi: 10.1016/j.bbagen.2019.129433. Epub 2019 Sep 11. PMID: 31520681.
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