环境DNA采样技术在生物多样性研究、入侵物种监测等方面的应用
一：主要研究内容
1、生物多样性研究：
Thomsen等从丹麦的一个海洋生态系统中采集海水，利用环境DNA metabarcoding技术研究海洋鱼类生物多样性。在获得的环境DNA中发现了15种不同的鱼类，其中包括一些用传统监测方法很难发现的稀有物种。同时与9种传统的海洋鱼类调查方法比较，环境DNA检测出的鱼类多样性与其他传统方法相当，甚至优于传统方法。Thomsen等研究表明从湖泊、池塘和河流的少量水样中直接获得DNA，可以检测并定量分析研究区域内珍稀及濒危淡水动物(两栖类、鱼类、哺乳类、昆虫类和甲壳类)多样性。同时表明通过池塘水中分离的DNA，利用第二代测序技术可以检测到研究区域内两栖类和鱼类群体，环境DNA可以作为监测珍稀濒危物种的工具，应用于更广泛的物种监测中。
应用环境DNA metabarcoding技术不仅可以针对当前的生物多样性进行有效的评估，也可以对过去的动植物群落的多样性进行评估。Epp等通过对过去和现在的环境DNA进行metabarcoding研究，所有目标类群都能通过metabarcoding的方法检测出来，但是类群之间和不同年代的环境样品所检测的结果存在较大变异范围。
目前国内在应用环境DNA metabarcoding技术研究生物多样性的报道还比较少。
2、外来入侵物种监测：
目前外来入侵物种的情况日趋严重。当外来物种入侵时，入侵物种很有可能破坏原本的生态平衡，使生态系统不完善，从而对本地物种的种类和数量产生影响。但是在早期入侵阶段外来入侵物种通常数量不多，使用传统的检测方法耗时且效率不高，难度高，不能及时被发现。这会导致外来入侵物种对本地生态平衡的危害达到最高值时才受到重视，为时已晚。环境DNA metabarcoding增强了对入侵物种早期监测的可能性，可以有效地遏制物种入侵。
研究发现利用环境DNA metabarcoding可以从淡水中提取环境DNA，检测出外来入侵物种的存在。Ficetola等最早将环境DNA metabarcoding应用于物种监测，他们使用特异性引物扩增短线粒体DNA序列追踪在受控环境和自然环境中一种入侵牛蛙(Rana catesbeiana)的存在，发现对环境中低密度的物种，使用metabarcoding技术仍然可以进行快速有效的物种检测。这是首次结合大规模测序和DNA条形码技术的发展来进行物种识别，为利用环境DNA监测外来物种提供了新方法和新思路。
Jerde等利用环境DNA研究美国芝加哥地区河流中的两种入侵亚洲鲤科鱼(Hypophthalmichthys molitrix和H.nobilis)，发现使用传统电气捕鱼法检测到一条鱼需要93人的努力，而环境DNA metabarcoding方法检测到目标物种只需要0.174人d。在亚洲鲤科鱼种群密度很低的区域，只有环境DNA方法能够检测到这两种鱼。
可见，环境DNA metabarcoding方法不仅在时间和资金成本上优于传统监测方法，而且可以在种群密度很低的环境样本中灵敏地检测到入侵物种的存在。
Piaggio等捕获入侵佛罗里达州的半水栖物种缅甸巨蟒(Python bivittatus)，放置于90L的水箱中评估水中环境DNA的降解速率，结果表明缅甸巨蟒的DNA在96h以内都可以检测到。在佛罗里达州6个野外地点采集的水样中，有5个地点的缅甸巨蟒环境DNA为阳性，这与缅甸巨蟒的野外分布结果一致。
Takahara等使用环境DNA方法采集日本海岸以及周围岛屿的70个水样对一种入侵蓝腮太阳鱼(Lepomis macrochirus)进行检测。利用蓝腮太阳鱼的特异性引物(100bp的Cyt b片段)扩增水环境DNA，结果表明70个池塘中有19个池塘遭受蓝腮太阳鱼的入侵。尽管鱼的大小、习性等因素对实验结果有一定影响，但使用环境DNA metabacoding提高了监测入侵物种的准确度。
3、稀有物种保护：
通过水体中的环境DNA可以有效检测水生脊椎动物，并且已在湿地和大型河流研究中得到证实。利用环境DNA检测河流中的稀有物种和隐秘物种可以增加调查结果准确性，减少调查成本。Goldberg等利用metabarcoding技术，通过收集快速流动的水体环境DNA样本，对尾突角蟾(Ascaphus montanus)和爱达荷陆巨螈(Dicamptodon aterrimus)两种珍稀物种进行监测。设计特异性引物尾突角蟾和爱达荷陆巨螈的线粒体Cyt b区域的85bp和78bp片段，在5个不同物种密度的水样中均成功进行了PCR扩增并灵敏地检测到了目标物种的存在。该研究还发现早春季节比早秋季节更难以检测到两栖类物种存在，推测可能是由于早春比早秋温度更低，降低了生物代谢速率而导致。
Foote等从海水中分离DNA，使用特异性引物扩增线粒体DNA区域60—80bp的片段检测水体中是否存在港湾鼠海豚(Phocoena phocoena)，对控制条件下和自然条件下该物种进行遗传监测。在一个样地中检测到长肢领航鲸(Globicephala melas)，而该物种极少在研究海域被发现，结果表明环境DNA的方法可用于检测稀有物种。
Wilcox等利用环境DNA结合定量PCR检测了河流中的两个稀有物种，美洲红点鲑(Salvelinus fontinalis)和强壮红点鲑(S.confluentus)，同时发现定量PCR(qPCR)比传统PCR更加灵敏，检测概率更高。Rees等利用环境DNA和传统的实地调查方法开展对英国珍稀保护物种冠北螈(Triturus cristatus)的监测，野外调查发现有冠北螈分布的地点中，采集的水样DNA中成功检测出冠北螈的概率为84%。使用环境DNA方法监测物种，对物种及其生存环境不会造成损害。随着测序成本的下降，环境DNA与metabarcoding技术结合应用在许多情况下甚至优于一些传统监测方法，成为物种监测方法的又一选择。
4、一些补充说明：
使用环境DNA监测水生生物时，必须保证能获得该环境的完整样品并能进行很好的保存。水体的温度和光照情况，水体的流速，物种密度和在环境中的停留时间，生物体的发育阶段等均会对环境中所取的DNA的量造成影响。
Maruyama等对水体中DNA的半衰期进行了研究和计算，发现鱼类离开此水体后环境DNA的半衰期是6.3h，但对环境DNA降解速率及其影响因素，环境DNA在环境中存在时间的长短等问题仍缺乏充分的了解。
在采集溪流水样时，由于许多溪流水来自于地下水，所以接触到目标生物脱落DNA的可能性较低。此外，由于溪流水水位浅而且是充分混合的，因此脱落的DNA被光降解的可能性更大，导致在溪流中检测到的目标物种密度会比较低。使用环境DNA metabarcoding技术对淡水中的物种进行检测已被证实快速有效。淡水中水流较平和且流量小，所以准确度高。与淡水相比，海洋生态系统中有单位体积中的生物量比例更大，海流和波浪的影响作用，以及盐度对保存和提取环境DNA的影响都需要加以考虑。这些因素可能意味着海水中的环境DNA不太集中，且分散更迅速，提取DNA时比较困难，导致在海水中使用时只能针对一小片区域，并且对外来入侵物种的检测效率不高。因此在海水中的使用还需要进一步的研究与完善。
二：水环境eDNA采样设备
便携式eDNA采样器——上海蔚雨科技有限公司
设备优势
1、可记录采样点流速、GPS、温度等信息
2、内置计算机，可导出采样日志、为每个样品标注采样编码
3、采样饱和后具有震动反馈功能，可设置定量采水
4、具备远程蓝牙遥控采水功能
5、可进行多通道的同步采样
6、自封滤膜（技术）：采用合成树脂材料自动对样本进行脱水处理，使DNA信息能在室温下保存90天不降解（传统采样方式需要对样品进行乙醇加注、冷冻、防腐等措施，费时费力，往往会在采样点浪费大量时间）
①降低污染——传统样品处理方式需要现场对样品进行防腐处理，会增加污染可能。
②提高DNA含量——与传统使用乙醇相比，检测到的DNA含量是其2倍。
③提高效率——现场无需准备乙醇及缓慢的过滤工作，无需准备冷冻措施低温保存样品，即便是没有相关从业经验的人员即可快速上手实现标准化的采样工作。
设备标配自封滤膜套装self-preserving packs——封装后即可邮寄至我司合作实验室分析
三：分析流程及结果
环境DNA提取——设计合成引物接头——PCR扩增产物纯化——PCR产物定量均一化——测序文库构建——高通量测序——生成报告
样品报告包括但不限于：
1、物种多样性统计
2、物种组成分析
3、群落比较分析
4、捕捞数据一致性分析
