Celigo成像分析技术在细胞杀伤中的应用
如今炙手可热的PD-1， CAR-T，TCR-T技术等都要归功于这一伟大发现及其临床应用。如果你的工作也和免疫疗法相关，是不是像小编一样也有一丢丢自豪，感觉自己参与见证了人类疾病史上的一次飞跃呢？
鸡血打满了，该好好干活了！
无论名字多么fancy的疗法，有没有用还是得看它能否消灭肿瘤细胞。在体外实验中，抗体或经改造的免疫细胞（效应细胞）对肿瘤细胞（靶细胞）的杀伤是评估疗法效价的不可缺少的评判标准之一。多年来，科学家们已开发出了多种免疫细胞杀伤的检测方法，小编总结如下：
这些方法原理不同，也各有利弊。比如许多实验室常用的乳酸脱氢酶 (LDH) 释放法是通过检测细胞裂解后释放到培养基中的LDH来反映细胞的杀伤程度的。然而免疫细胞和肿瘤细胞中都含有LDH，死亡后都会释放到培养基中，因此酶标仪的读数无法特异性地区分出肿瘤细胞的死亡，结果容易受到死亡的免疫细胞的影响。另外，该方法需设置多组对照，如无释放组（不加免疫细胞）和最大释放组（加Triton X-100完全裂解）来确定最低和最高的OD值读数。如果对照组和实验组的细胞铺板密度不均匀，极易造成误差，甚至出现实验组杀伤效率为负数的奇怪结果。
再比如Luciferase报告基因法，是将Luciferase的基因片段连接在与T细胞激活相关基因 (比如IL-2或NFAT) 的启动子之后，通过Luciferase的表达来反映T细胞的激活程度。简言之是在分子水平检测T细胞的激活。做该实验需自行改造T细胞或购买改造好的T细胞系，不够灵活，具有较大的局限性。
列表中的所有方法还有一个共同缺憾，就是看不到细胞。有图才有有真相，细胞杀伤连个细胞的影子都没有，光让咱们相信这些数字，心里是不是有点虚？实验失败了也很难找原因。另外每次实验只能测一个时间点，想测多个时间点得铺多块板，想想就好累！
检测免疫细胞杀伤有没有既靠谱又简单的方法呢？谁说没有呢？科技的发展日新月异，小编今天就给大家介绍一下做免疫细胞杀伤的最新方法：
Calcein AM染色法
• Calcein AM是一种可以渗透细胞膜的染料，通常用来检测真核细胞的存活率
• 在活细胞中，本来不发荧光的Calcein AM被胞内酯酶水解后转化为成发绿色荧光的Calcein
• 在细胞杀伤实验中，用 Calcein AM标记靶细胞，发出绿色荧光；效应细胞不染色以示区别。当靶细胞裂解后，由于胞内的Calcein释放到培养基中，细胞失去荧光。通过计算绿色荧光细胞的数量即可得到活靶细胞数和细胞杀伤效率。
*详细原理可查阅我司Nexcelom Bioscience和德克萨斯大学MD Anderson癌症研究院合作发表的文献【1】。
这么好的方法当然需要一个强大的检测仪器来支撑 – Celigo成像细胞定量分析仪：
● 明场+四色荧光
● 全孔成像，图片清晰，适用于6-1536孔板
● 定量分析全孔细胞数目
● 软件自带流式设门分析功能
● 高速同步成像和分析，15分钟内完成一块96孔板的免疫杀伤检测
现在小编就以NK细胞的ADCC（抗体依赖细胞介导的细胞杀伤）为例子来展示用Celigo做免疫细胞杀伤的效果：
• 全孔成像，分析孔内每一个细胞
• 避免细胞分布不均带来的局部视野误差
• 多时间点检测时，避免因细胞迁移而造成的局部视野前后不一致
• 绿色荧光通道展示被Calcein AM标记的靶细胞
• Celigo软件将细胞圈定，便于用户查看细胞识别是否准确
• 在不同时间点将板放入Celigo进行检测
• 随着时间的推进，绿色荧光细胞（即活的靶细胞）的数量逐渐减少
*每孔下方数字为0小时绿色荧光细胞密度
• Celigo软件自动生成每孔绿色银光细胞随时间变化的曲线，各孔杀伤情况一目了然
• 原始数据可导出为Excel或GraphPad格式进行后续分析
t0为0小时；t为检测时间点；treated为加抗体组；control为未加抗体组
• 如上计算公式即可算出每孔的细胞裂解率
• 每孔数据都由该孔0小时和检测时间点的荧光细胞数相比较得出，不需额外设置对照组，避免了不同孔间铺板密度的差异造成的误差
• 根据数据绘制出细胞裂解曲线
• 将明场和绿色荧光图片叠加，可观察NK细胞和肿瘤细胞间的相互作用
• 在一定抗体浓度下，随着时间的推进，NK细胞逐渐在肿瘤细胞周围聚集，时间越久聚团越明显，活的肿瘤细胞也越少
• 在相同时间点，随着抗体浓度的增高，NK细胞逐渐在肿瘤细胞周围聚集，浓度越高聚团越明显，活的肿瘤细胞也越少
有了这样的图片，你是不是会底气十足地在组会上汇报：肿瘤细胞真的被免疫细胞杀得片甲不留，此乃我亲眼所见！
除了NK细胞, Calcein AM染色法也能运用在PBMC、CIK、中性粒细胞、CAR-T等其他免疫细胞的杀伤。不过呢，Calcein AM也有一个小小缺点，那就是它的荧光半衰期太短，所以该方法只适用于时程较短（< 6小时）的杀伤实验。如果你的杀伤实验时程较长也不用担心，Nexcelom的科学家们早已开发出其他方法来应对各种各样的实验条件，需要了解的可以给小编留言噢，我们也会在今后的文章中作详细介绍，敬请期待！
参考文献
【1】Somanchi S S, McCulley K J, Somanchi A, et al. A novel method for assessment of natural killer cell cytotoxicity using image cytometry[J]. PLoS One, 2015, 10(10): e0141074.
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