双转盘共聚焦技术：长时间活细胞3D动态观察和分析利器

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅识别某一特定抗原表位的抗体，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等众多优点。单克隆抗体技术的问世经历了人鼠嵌合单抗、人源化单抗阶段，这些工程改造抗体不仅为免疫学领域带来了一次革命，而且在生物医学的各个领域得到极广泛的应用。如今在临床上，单克隆抗体也被广泛用于肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病的治疗。
 

在单抗药物研发的早期阶段，目前普遍的共识是：抗体是筛出来的！这就要求对整个筛选规模的通量和自动化有较高的要求，并在合适的方法学模型下“大浪淘沙”，获得真正有效的hit！然而，目前单抗药筛选方法无论是ELISA还是FACS，虽然沿用多年，但都存在种种缺陷和不足：
 

1.整个样品准备过程流程复杂，步骤繁琐，中间涉及到多次的离心、洗涤、孵育再离心和洗涤孵育的过程，费时费力。

2.ELISA：具备一定的通量并能实现自动化，但是实验结果基于纯化的包被抗原，无法获得符合真正生理情况下细胞水平的数据，往往导致假阳性过高，一般只作为初筛。

3. FACS：通量较低，虽有高通量的流式细胞仪问世，复杂繁琐的样品准备流程依旧是个短板，无法满足日益增加的筛选通量需求。此外FACS容易堵塞，需要清洗，维护麻烦，更无法实现机械臂整合后的自动化。

二、mirrorball：一步法，真正的免洗
 

由于ELISA和FACS的种种缺陷，英国著名的创新实验室自动化仪器厂商SPT Labtech为此研发了新一代的抗体药物筛选平台mirrorball，其独有的均相混合即读模式（Mix & Read）是专门为细胞水平的高通量抗体筛选所设计。实验时，只需将细胞（无论是贴壁还是悬浮）或微珠、待测的抗体（如杂交瘤上清）以及荧光二抗混合在一起孵育，直接读板，获得数据，中间不需要任何洗涤的步骤。
 

真正的一步法检测
 

mirrorball 免洗原理：底读+双染

首先，mirrorball的激光只会读取沉降到微孔板底部的细胞，从而避免细胞上方背景荧光二抗的干扰。

仅排除上方的背景信号是不够的
 

其次，用活细胞染料如Dio或CFSE标记细胞，加入待测的一抗以及相应的红色荧光二抗如Alexa647，同时能检测到绿色和红色信号的细胞即为阳性结合，红和绿的共定位，在仪器中显示为黄色信号，从而排除背景的荧光二抗。
 

双阳的共定位细胞即为阳性孔

三、mirrorball主要应用

1. 针对细胞表面抗原的抗体筛选：这是mirrorball最常见也是最广泛的应用。例如在感兴趣靶点的细胞上，加入待测的一抗如杂交瘤上清、细胞染料和荧光检测二抗，中间无需任何洗涤过程，孵育1-2小时后直接读板检测，同时有细胞和荧光二抗共定位信号的孔即为阳性结合孔。
 

384孔杂交瘤筛选workflow


384孔板结果，绿色为阳性孔


可导出直观的hot map
 

2. 多重检测(multiplex):mirrorball可以在一个孔内同时检测阴性和阳性对照并进行多指标分析。具体方法为,用蓝色的染料如Hoechst标记阴性细胞，用绿色染料如Dio标记阳性对照细胞，将两种细胞混在一起后，在加入待测的抗体以及相应的荧光二抗。mirrorball能区分并准确定位每个孔内的绿色和蓝色细胞，同时分别统计绿色和蓝色细胞上红色荧光二抗的信号。在这个实验中，只有绿色阳性细胞上有红色抗体信号同时蓝色细胞上没有的孔才是真正的阳性孔。这个实验无论ELISA还是流式都必须做两次，mirrorball可一步完成，节省一半的试剂和试剂耗材。

多重检测protocol

 

3. 微珠检测：除了细胞水平的筛选外，mirrorball也可以采用和ELISA类似的方法，将纯化的抗原（标记biotin）包被在带SA的微珠上，同样可进行抗体的筛选。相比于ELISA，不但免洗而且所需抗原包被的用量仅为ELISA的1/10，可节省宝贵的抗原。

mirrorball可检测微珠上的散射光
 

此外，mirrorball也可以进行基于微珠的多重检测和分析，市场上可以买到不同大小的微珠或者不用颜色的微珠，在同一孔内，mirrorball可以准确定位和区分这些不同大小和颜色的微珠，并分别检测上面是否有阳性的抗体结合。

利用不同的微珠进行多重分析
 

4. 竞争结合实验：mirrorball上还可以实现免洗竞争结合实验。例如 类似于竞争性ELISA。步骤很简单，在微珠上包被二抗，然后加入固定量的荧光标记一抗和待检测的一抗，混合在一起，孵育一段时间，读板获取分析数据，并获得相应的IC50。

竞争结合实验protocol及分析结果
 

5. 全自动，整合机械臂：mirrorball可整合机械臂机和叠板架，一天可轻松完成80块384孔板的筛选通量，其中样品准备的时间小于2小时，实现真的无人值守式的抗体筛选新模式。

无人值守，高通量筛选


四、结束语

mirrorball自问世以来，以其简洁、快速和高效的抗体筛选模式，广受诺华，罗氏，Genentech，礼来，GSK，药明康德，睿智化学，恒瑞，和铂，岸迈，三生国建，华海药业等各大跨国药企、生物技术公司和CRO的青睐。mirrorball致力于用更简单的流程、更少的抗原用量、更低的人力和试剂成本、更高的通量去筛选到更好质量的抗体！