全景组织细胞定量分析系统技术在新冠肺炎相关方向研究
TissueFAXS Cytometry技术在新冠肺炎相关方向研究
2月17日，上海交通大学医学院附属瑞金医院新冠肺炎病因诊断专家组踏上征程。该专家组由国家卫健委委派，赴武汉开展新冠肺炎病理学和病因诊断研究工作。他们的主要任务是进行新冠肺炎病例的病因分析，深入研究疾病发生发展的病理生理过程，并为后续研究提供重要科学支撑。与此同时，全国首批新冠肺炎逝者遗体解剖也已在武汉金银潭医院完成。
为什么病理学信息至关重要？
目前，临床上对于新冠肺炎的了解和认知大都来源于临床症状、影像学、检验分析、病毒分析等方面研究。但要真正直观地了解器官的损伤、如何损伤、体内器官损伤如何相互关联影响等问题，都需要通过病理学信息来解决。
病理学家指出，「对于新冠肺炎而言，通过病理解剖研究疾病发生机理，有助于帮助临床纠正可能的错误诊疗方案。此外，超微结构、分子病理等方面研究也可以帮助其他领域的专家做很多事情。」
COVID-19患者的病理学特征
SARS-CoV-2感染患者的双肺、肝脏及心脏组织病理标本（Zhe Xu, Lei Shi, Yinjin Wang.etal. Pathological findings of COVID-19 associated with acuterespiratory distresssyndrome. Lancet Respir Med 2020）
根据解剖完成的肺组织切片镜下可见，COVID-19的患者存在弥漫性的肺泡损伤，伴有支气管上皮剥脱、纤毛脱落、鳞状上皮化生等病变；以及肺泡壁大量的炎性渗出，导致患者呼吸困难、血氧含量降低。死者大部分肺泡和肺间质巨噬细胞浸润、肺泡上皮细胞增生，形成双嗜性胞浆丰富的多核巨细胞。
病理学信息是重大疾病确诊的最终诊断标准，组织图像中细胞不是独立存在的，而是交织、混杂在一起，同种细胞形态上有时也会存在较大差异，要想做到组织图像中每个单细胞标记marker的准确量化、准确的单细胞识别是后续量化的基础。TissueFAXS Cytometry专利的单细胞识别技术，可以做到组织内不同大小、染色强度、形态等差异性非常大的细胞核、质、膜多组分准确识别，保证细胞统计准确性，为后续量化分析奠定了坚实基础。
TG & COVID-19
奥地利TissueGnostics公司的TissueFAXS Cytometry专利技术是一种基于全景组织细胞定量分析系统的图像处理的病理定量分析技术，能够实现包括超大尺寸病理切片全景扫描和细胞培养样本的数字化全息获取；从亚细胞到组织水平的大数据定量分析；目标细胞/组织/结构空间分布水平数字化定量以及完成从体视学到大数据的双向独立、可重复的验证。
针对新冠肺炎的研究，TissueFAXS Cytometry技术具有极大的应用意义。
TissueFAXS Cytometry技术相关案例1
无标记形态学识别及定量分析肺组织中的支气管/血管/肺泡
通过颜色及形态学参数，在识别肺泡细胞/支气管上皮细胞/血管内皮细胞/红细胞的基础上，对无特殊染色标记的肺组织中支气管、血管、肺泡的数量/大小/形态进行定量分析。
TissueFAXS Cytometry技术相关案例2
HE染色下自动识别并定量肺肿瘤/血管/炎性渗出区域/正常肺泡区域
原始影像
TissueFAXS Cytometry技术支持超大组织样本切片全景扫描和定量分析，协助科研工作者们突破从分子水平、细胞水平、组织水平直至器官水平的数据瓶颈，分析不同分子/蛋白在不同组织内部及相邻器官中的数量、形态、类型、分布等信息，从微米尺度到厘米尺度，真正做到100％还原原始样本！
TG在病毒分子机制研究中的应用发表文章节选
致死性流感肺炎的严重程度取决于OX40L表达。由于OX40L能够与细支气管肺泡干细胞的流感病毒相结合，流感感染时通过增加细胞数量以介导上皮修复，并诱导其表面的OX40L表达从而刺激免疫反应。然而，宿主的防御反应将会导致更广泛的感染，最终造成过度的免疫防御反应而致死。
F，G： 对比致死剂量的A / H1N1流感病毒（Flu）和生理盐水（Mock）气管内感染的WT小鼠肺细支气管的免疫荧光样本，因为CCSP（红色）和SPC（绿色）双阳性表达被认为是细支气管肺泡干细胞的特征，用来反映支气管肺泡干细胞的存在与否。
由TissueFAXS系统扫描的影像数据进行定量分析得出，甲流病毒的感染使终末细支气管CCSP免疫反应性细胞的脱落，但CCSP/SPC双阳性细胞则更多的在远端支气管部位出现，修复受损的上皮。
细胞膜表面分子AXL在寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）染星形胶质细胞的过程中扮演着重要角色，但它并不是ZIKV进入星形胶质细胞的主要受体，AXL分子主要通过STAT1/STAT2通路调控SOCS1分子表达，进而抑制I型干扰素信号应答，最终促进ZIKV在宿主细胞中复制。该研究发现的ZIKV感染神经细胞的新机制，为研发新型有效的ZIKV防御技术提供了生物学新靶点。
病毒分离鉴定十分复杂，利用StrataQuest软件对免疫荧光、原位杂交的扫描图像进行分析，独有的细胞质形态识别功能，可以十分清晰的看到病毒的复制数量、作用靶点以及空间分布位置，为明确病毒感染细胞的作用机制提供有效的帮助。
研究人员对人肺组织、人源化小鼠CD4+T细胞以及结核分枝杆菌（Mtb）/ 猴免疫缺陷病毒（SIV）非人灵长类共感染模型中的感染情况进行研究，表明肺实质CD4+T细胞对HIV-1依赖性细胞死亡具有耐受性，而CD4+T细胞在肺间质而不是肺泡腔中的缺失非常显著，CD4+T细胞的缺失与肺外播散有关，研究还证明了肺间质CD4+T细胞是HIV-1和SIV感染的有效靶点，使得其早期衰竭缺失和播散性肺结核的风险增加。
严谨的科学研究需要客观、量化的数据支持，针对于肺部等组织免疫细胞的数量关系、空间位置分布情况以及相互作用关系，TissueFAXS Cytometry技术可以提供组织原位精准定量的数据结果，将极大的推动研究者们的科研进展。
2月17日，上海交通大学医学院附属瑞金医院新冠肺炎病因诊断专家组踏上征程。该专家组由国家卫健委委派，赴武汉开展新冠肺炎病理学和病因诊断研究工作。他们的主要任务是进行新冠肺炎病例的病因分析，深入研究疾病发生发展的病理生理过程，并为后续研究提供重要科学支撑。与此同时，全国首批新冠肺炎逝者遗体解剖也已在武汉金银潭医院完成。
为什么病理学信息至关重要？
目前，临床上对于新冠肺炎的了解和认知大都来源于临床症状、影像学、检验分析、病毒分析等方面研究。但要真正直观地了解器官的损伤、如何损伤、体内器官损伤如何相互关联影响等问题，都需要通过病理学信息来解决。
病理学家指出，「对于新冠肺炎而言，通过病理解剖研究疾病发生机理，有助于帮助临床纠正可能的错误诊疗方案。此外，超微结构、分子病理等方面研究也可以帮助其他领域的专家做很多事情。」
COVID-19患者的病理学特征
根据解剖完成的肺组织切片镜下可见，COVID-19的患者存在弥漫性的肺泡损伤，伴有支气管上皮剥脱、纤毛脱落、鳞状上皮化生等病变；以及肺泡壁大量的炎性渗出，导致患者呼吸困难、血氧含量降低。死者大部分肺泡和肺间质巨噬细胞浸润、肺泡上皮细胞增生，形成双嗜性胞浆丰富的多核巨细胞。
病理学信息是重大疾病确诊的最终诊断标准，组织图像中细胞不是独立存在的，而是交织、混杂在一起，同种细胞形态上有时也会存在较大差异，要想做到组织图像中每个单细胞标记marker的准确量化、准确的单细胞识别是后续量化的基础。TissueFAXS Cytometry专利的单细胞识别技术，可以做到组织内不同大小、染色强度、形态等差异性非常大的细胞核、质、膜多组分准确识别，保证细胞统计准确性，为后续量化分析奠定了坚实基础。
TG & COVID-19
奥地利TissueGnostics公司的TissueFAXS Cytometry专利技术是一种基于全景组织细胞定量分析系统的图像处理的病理定量分析技术，能够实现包括超大尺寸病理切片全景扫描和细胞培养样本的数字化全息获取；从亚细胞到组织水平的大数据定量分析；目标细胞/组织/结构空间分布水平数字化定量以及完成从体视学到大数据的双向独立、可重复的验证。
- HE／IHC样本组织：自动对简单HE染色下肺组织中所有细胞轮廓进行识别，结合自动肺泡/支气管的组织识别功能，迅速判断炎性细胞数量、浸润程度、上皮脱落面积、纤维化程度等指标。
- IF样本组织：结合标记特异性蛋白Marker的免疫组化或免疫荧光技术，可以更进一步研究肺组织微环境中浸润的免疫细胞表型、上皮细胞化生程度等实验室精准定量指标。
- 病毒原位研究：利用特异性核酸荧光探针以及免疫荧光技术，共同标记病毒相关蛋白的表面抗原及核酸核心，不但可以从图像中精准定量病毒在细胞内外的数量及位置 — 建立通中过肉眼可以判断的病毒载量定量标准，同时分析病毒的增殖侵袭过程和组织的相互空间关系！
TissueFAXS Cytometry技术相关案例1
无标记形态学识别及定量分析肺组织中的支气管/血管/肺泡
肺组织原始影像
支气管识别
肺血管识别
肺泡识别
肺泡二维散点图定量分析
通过颜色及形态学参数，在识别肺泡细胞/支气管上皮细胞/血管内皮细胞/红细胞的基础上，对无特殊染色标记的肺组织中支气管、血管、肺泡的数量/大小/形态进行定量分析。
TissueFAXS Cytometry技术相关案例2
HE染色下自动识别并定量肺肿瘤/血管/炎性渗出区域/正常肺泡区域
原始影像
肺部肿瘤（红）、血管（粉）、炎性渗出区域（绿）、正常肺泡区域（黄）的识别
根据肺部肿瘤、炎性细胞等组织的颜色及形态学特性，对无特殊染色标记的组织病灶及结构进行识别，并用不同颜色标记以便进行后续的定量分析。TissueFAXS Cytometry技术支持超大组织样本切片全景扫描和定量分析，协助科研工作者们突破从分子水平、细胞水平、组织水平直至器官水平的数据瓶颈，分析不同分子/蛋白在不同组织内部及相邻器官中的数量、形态、类型、分布等信息，从微米尺度到厘米尺度，真正做到100％还原原始样本！
TG在病毒分子机制研究中的应用发表文章节选
- 流行性感冒和肺炎的分子机制研究 （日本东北大学医学研究院）
致死性流感肺炎的严重程度取决于OX40L表达。由于OX40L能够与细支气管肺泡干细胞的流感病毒相结合，流感感染时通过增加细胞数量以介导上皮修复，并诱导其表面的OX40L表达从而刺激免疫反应。然而，宿主的防御反应将会导致更广泛的感染，最终造成过度的免疫防御反应而致死。
F，G： 对比致死剂量的A / H1N1流感病毒（Flu）和生理盐水（Mock）气管内感染的WT小鼠肺细支气管的免疫荧光样本，因为CCSP（红色）和SPC（绿色）双阳性表达被认为是细支气管肺泡干细胞的特征，用来反映支气管肺泡干细胞的存在与否。
由TissueFAXS系统扫描的影像数据进行定量分析得出，甲流病毒的感染使终末细支气管CCSP免疫反应性细胞的脱落，但CCSP/SPC双阳性细胞则更多的在远端支气管部位出现，修复受损的上皮。
- AXL受体-星形胶质细胞反应相关研究（上海复旦大学附属金山公共卫生临床中心）
图1：AXL蛋白敲除抑制ZIKV在原代星形胶质细胞中复制
a,b: ZIKV感染WT和AXL基因敲除的人原代星形胶质细胞并分析
c,d: 分离出一个AXL基因敲除的U-251MG克隆并进行rescued验证并分析
图2：原位杂交检测ZIKV RNA，ZIKV进入细胞不依赖于AXL分子，但通过IFNAR信号依赖机制保护星形胶质细胞；
b,c：ISH法检测ZIKV RNA，并对内部的ZIKV RNA进行数据统计分析g,h：AXL基因敲除介导的ZIKV复制能力受到IFNAR1信号通路控制，IFNAR信号依赖机制可以有效保护星形胶质细胞病毒分离鉴定十分复杂，利用StrataQuest软件对免疫荧光、原位杂交的扫描图像进行分析，独有的细胞质形态识别功能，可以十分清晰的看到病毒的复制数量、作用靶点以及空间分布位置，为明确病毒感染细胞的作用机制提供有效的帮助。
- HIV/SIV及结核病的相关性研究（美国麻省理工学院，哈佛医学院）
图2：HIV-1感染导致体内肺间质CD4+T细胞严重耗竭
G,H,I: IHC染色证实，感染7周后比较肺CD4+T细胞与脾脏CD4+T细胞的耗竭情况（G），并应用Histoquest软件对肺和脾脏中的CD4+细胞进行定量（H、I）
G,H,I: IHC染色证实，感染7周后比较肺CD4+T细胞与脾脏CD4+T细胞的耗竭情况（G），并应用Histoquest软件对肺和脾脏中的CD4+细胞进行定量（H、I）
图3：肺中的CD4+T细胞对体内产生HIV-1感染具有高度敏感性
C,D：通过利用IHC对HIV-1p24蛋白染色情况证实肺CD4+细胞有HIV病毒产生（C），并应用Histoquest软件对肺和脾脏中p24+细胞与CD4+细胞的比值进行定量分析
实验人员对肺部及脾脏组织的CD4+T IHC切片进行组织原位扫描明确感染部位及CD4+的分布情况并对CD4+细胞进行定量分析，发现CD4 + T细胞高度允许HIV-1诱导的细胞死亡而HIV-1感染不会明显改变肺泡CD4 + T细胞数量。但是，SIV感染导致肺结核期间间质CD4 +T细胞耗竭并进一步证实出肺间质CD4 + T细胞丢失与播散性结核有关。严谨的科学研究需要客观、量化的数据支持，针对于肺部等组织免疫细胞的数量关系、空间位置分布情况以及相互作用关系，TissueFAXS Cytometry技术可以提供组织原位精准定量的数据结果，将极大的推动研究者们的科研进展。
