PeproTech 为您总结小鼠小肠类器官培养方法与技术要点

♦ 前言 ♦

1）肠道外部的膜、血管和脂肪，尽量去除干净，否则后续得到的分馏会有很多杂细胞污染；
2）用注射器往肠腔内注入PBS，冲洗掉小肠内容物，可以减少后续洗涤时间；
3）用无菌的载玻片刮去小肠内绒毛组织，尽量去除干净，可以减少杂细胞的产生，另外可以有助于小肠组织的消化，得到更多的小肠隐窝；
4）小肠隐窝消化液用5 mM的EDTA，注意EDTA是否有析出，如析出太多会影响终浓度，有必要更换新的EDTA；
5）因分离小肠隐窝需要时间较久，建议整个操作在低温进行，离心机调至4℃，PBS放冰上。试用移液器前用冷的PBS润洗移液器枪头；
6）EDTA消化后，小肠组织会变松散，在外界机械力作用下，小肠隐窝会从组织中分离出来，可以重复几次通过外界机械力作用得到不同的分馏组分，可以挑选隐窝含量较高，杂细胞较少的分馏组分种板培养；
7）得到分馏组分后进行隐窝计数，用完全培养基重悬隐窝至8~20个/uL，加入等体积基质胶混合，该过程一定要在冰上操作，混合过程切勿产生气泡，否则影响后续观察以及隐窝培养状态，混匀过程可以调小量程，吸取的液体不要全部吹出；
8）购买的基质胶在冰上融化后分装冻存，操作过程中基质胶一定要放在冰上，未用完的液体状基质胶可以冻存，若凝固后请弃去。
9）基质胶种板前需要将培养板放入培养箱温浴30min，拿出培养板后尽快种板，以便形成更好的基质胶圆顶结构。

1）在成熟类器官的24孔板中，每孔加入约1000基础培养基，用1 mL枪头吹打板底的基质胶，直到基质胶全部打碎，收集每个孔中的悬液置于15 mL离心管中；
2）将全部打碎的基质胶悬液冰上放置5～10 min；可用1 mL大枪头继续吹打悬液，此过程避免产生气泡（调制量程到700 μL可避免气泡产生），可取适量的悬液观察，直至看不到大块的类器官团块为止；
注：此过程也可将全部打碎的基质胶悬液吸入胰岛素注射器内，再将悬液通过胰岛素注射器针头打出，通过机械力将类器官团块分离。

1）将需要冻存的类器官冰上放置5～10 min；
2）收集类器官，步骤同之前传代收集步骤一致；
3）离心后弃上清，用800 μL的冻存培养液重悬，将悬液移至冻存管中，放入冻存盒中于-80 ℃冰箱中保存24 h，如需长久保存，则24 h后转移至液氮罐保存。

复苏准备：37 ℃水浴箱
从液氮中取出冻存管后，立即放入37 ℃水浴中，使之迅速融解。等到冻存管中仅存一小片冰室，迅速将细胞转移到含9 mL冷的基础培养基中(先将之置于15 mL离心管中，放于冰上)。200 g 室温离心5 min，弃去上清，加入适量类器官培基重悬后与基质胶混合种板，待基质胶凝固后加入类器官培养基，将培养板放入培养箱。