GAL4系统酵母双杂交X-α-Gal酵母半乳糖苷酶 (MEL1) 显色底物使用及保存说明
基本描述：
X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷，CAS：107021-38-5），一种用来检测α-半乳糖苷酶（也称为蜜二糖酶，α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC 3.2.1.22）活性的显色底物。X-α-Gal的使用，避开双杂交分析中β-半乳糖苷酶溶液制备和滤膜提升实验（filter-lift assay）的繁琐操作，只需直接添加在培养基上，通过蓝色沉淀的生成与否，即可用来检测双杂交相互作用。X-α-Gal可用来区分肠杆菌科内的不同物种以及划分乳酸菌和双歧杆菌。组织学研究中，X-α-Gal还可借助光学显微镜来检测组织的α-半乳糖苷酶活性。
利用α-半乳糖苷酶水解二糖-蜜二糖作为碳源，酵母菌得以正常生长或进行发酵。酿酒酵母菌内，该酶由几种GAL基因调控的MEL1基因所编码。一旦GAL4激活，α-半乳糖苷酶分泌，之后水解培养基上的X-α-Gal，使得菌落产生蓝斑。酵母双杂交研究用的工程菌包括AH109，PJ69-2A，Y190和Y187。
酵母双杂交系统重要元件介绍（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）
一、诱饵（the bait）
为了建立GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白，推荐使用质粒pGBKT7；
要调查三元蛋白复合物，推荐使用含2个MCS区域的三杂交载体，能表达GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白和第二个感兴趣蛋白，在bait和prey蛋白之间发挥桥梁作用。
二、检测蛋白作用的四个报告基因
Matchmarker gold系统是采用4个报告基因/3个不同bait识别序列的双杂交系统（见图2）。其采用新型稳定的酵母双杂交抗生素- 金担子素Aureobasidin A （AbA）（货号：M0129），可有效杀死非抗性克隆，从而大大降低背景克隆生长。同时有效缩减假阳性，由于人和prey蛋白单独将结合引起假阳性都需要识别3个不同序列，激活4个报告基因的表达。
4个报告基因分别是：1个AbA抗生素筛选报告基因，2个营养筛选报告基因，1个蓝白斑筛选报告基因。
1） AUR1-C
AUR1基因的主要突变版，能够表达肌醇磷脂酰神经酰胺合成酶（Inositol phosphorylceramide (IPC) synthase）。当蛋白发生作用促使GAL4转录激活，AUR1-C基因进行表达。酿酒酵母中此基因的表达孵育其对高毒抗生素金担子素Aureobasidin A （AbA）的抗性。由于其背景极其低，这一筛选报告子由于单一的营养缺陷报告子。
2） HIS3
Y2HGold菌株不能合成组氨酸，从而无法在缺少这一必须氨基酸的培养基上生长。当诱饵和诱捕蛋白相互作用，Gal4反应性的His3表达促使细胞合成组氨酸并能在His缺陷培养基上生长。
3） ADE2
Y2HGold菌株无法在不含腺嘌呤的基本培养基上生长，但当两个蛋白相互作用，Ade2表达被活化，细胞能在Ade缺陷的基础培养基上生长。
4） MEL1
MEL1编码α-半乳糖苷酶，存在许多酵母菌内的天然表达蛋白。当双杂交发生，MEL1表达和分泌，在底物X-α-Gal（货号：M5831-100mg）存在的情况下，酵母菌落变为蓝色。
三、三个不同的结合位点（three different binding sites）
Y2HGold菌株三个启动子控制4个报告基因是不相关的，除UAS区域的短蛋白结合位点特异性结合Gal4 DNA-BD。因此，诱捕蛋白（文库蛋白或靶蛋白）与UAS内部或边缘的不相关序列作用（假阳性）就会自动被筛查出来。
Matchmarker酵母菌株的报告基因构造。Y2HGold中，HIS3，ADE2，MEL1，和AUR1-C报告基因分别由三个完全异源的Gal4反应启动元件-G1，G2，M1操控。而启动子内的蛋白结合位点是不同的，虽然每一个结合位点与Gal4识别的17-mer共有序列相关联。
酵母双杂交系统操作流程（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）
完整的Matchmarker筛选过程包含以下步骤：
第一步：执行对照实验；
第二步：诱饵载体的构建及自我激活和毒性检测；
第三步：筛选Mate&Plate文库
第四步：确认和阐释结果
X-α-Gal优势：
避开双杂交分析中β-半乳糖苷酶溶液制备和滤膜提升实验（filter-lift assay）的繁琐操作，只需直接添加在培养基上，通过蓝色沉淀的生成与否，即可用来检测双杂交相互作用。
缺点：
成本高
HIS3报告基因启动后，酵母可以在组氨酸确实的平板上生长；ADE2报告基因启动后，酵母可以在腺嘌呤（adenine）缺失的平板上生长；lacZ和MEL1报告基因是平行的，两个基因上游都是由MEL1 UAS和MEL1 TATA区域同时控制的，区别在于lacZ的产物是β-半乳糖苷酶，其底物是X-gal；而MEL1的产物是a-半乳糖苷酶，其底物是X-a-gal。考虑到成本，我们可以在LWH平板中加入X-gal来进行筛选，其效果与X-a-gal是相同的。因此由三种UAS共同调控的AH109系统可以较好地排除假阳性，并且也能检测结合强弱。
X-α-Gal与酵母双杂交系统：
酵母双杂交筛选是体内用来检测蛋白-蛋白相互作用的一种遗传分析实验，此方法由Prof. Stan Fields及合作者开发用来调查两个已知蛋白的相互作用，另一个重要应用是从文库内筛选并鉴定某一特定蛋白的未知结合蛋白。阳性克隆也就是那些能够激活报告基因转录子，使得营养缺陷型酵母双杂交菌株在营养缺陷选择性培养基上生长的菌落。大多数双杂交方法使用大肠杆菌的LacZ基因作为第二个报告基因，通常要使用非常耗时的filter-lift assay来鉴定能在第二种选择性平板上生长的菌落。而替换使用的X-α-Gal，可直接在营养缺陷性的选择培养基上来检测基于GAL4-转录子的双杂交作用。
基本特性：
1）CAS NO：107021-38-5
2）化学名：5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷；X-α-D-Galactoside X-α-D-半乳糖苷；
3）分子式：C14H15BrClNO6
4） 分子量：408.64g/mol
5） 纯度：≥98%（TLC）
6） 外观：白色或近白色结晶粉末。
运输与保存方法
冰袋运输。-20 ºC保存。
携带MEL1基因的酵母菌株：
Y2HGold、Y190、AH190、Y187、PG69-2A
X-Gal与X-α-gal不同：
X-Gal是E.coli β-半乳糖苷酶（LacZ）的反应底物，而X-α-gal是酵母α-半乳糖苷酶（MEL1）的反应底物。X-α-gal用作酵母双杂交系统中蓝白筛选的筛选标记。
http://www.warbio.cn/rczp/show-1078.html
X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷，CAS：107021-38-5），一种用来检测α-半乳糖苷酶（也称为蜜二糖酶，α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC 3.2.1.22）活性的显色底物。X-α-Gal的使用，避开双杂交分析中β-半乳糖苷酶溶液制备和滤膜提升实验（filter-lift assay）的繁琐操作，只需直接添加在培养基上，通过蓝色沉淀的生成与否，即可用来检测双杂交相互作用。X-α-Gal可用来区分肠杆菌科内的不同物种以及划分乳酸菌和双歧杆菌。组织学研究中，X-α-Gal还可借助光学显微镜来检测组织的α-半乳糖苷酶活性。
利用α-半乳糖苷酶水解二糖-蜜二糖作为碳源，酵母菌得以正常生长或进行发酵。酿酒酵母菌内，该酶由几种GAL基因调控的MEL1基因所编码。一旦GAL4激活，α-半乳糖苷酶分泌，之后水解培养基上的X-α-Gal，使得菌落产生蓝斑。酵母双杂交研究用的工程菌包括AH109，PJ69-2A，Y190和Y187。
酵母双杂交系统重要元件介绍（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）
一、诱饵（the bait）
为了建立GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白，推荐使用质粒pGBKT7；
要调查三元蛋白复合物，推荐使用含2个MCS区域的三杂交载体，能表达GAL4 DNA-BD/bait融合蛋白和第二个感兴趣蛋白，在bait和prey蛋白之间发挥桥梁作用。
二、检测蛋白作用的四个报告基因
Matchmarker gold系统是采用4个报告基因/3个不同bait识别序列的双杂交系统（见图2）。其采用新型稳定的酵母双杂交抗生素- 金担子素Aureobasidin A （AbA）（货号：M0129），可有效杀死非抗性克隆，从而大大降低背景克隆生长。同时有效缩减假阳性，由于人和prey蛋白单独将结合引起假阳性都需要识别3个不同序列，激活4个报告基因的表达。
4个报告基因分别是：1个AbA抗生素筛选报告基因，2个营养筛选报告基因，1个蓝白斑筛选报告基因。
1） AUR1-C
AUR1基因的主要突变版，能够表达肌醇磷脂酰神经酰胺合成酶（Inositol phosphorylceramide (IPC) synthase）。当蛋白发生作用促使GAL4转录激活，AUR1-C基因进行表达。酿酒酵母中此基因的表达孵育其对高毒抗生素金担子素Aureobasidin A （AbA）的抗性。由于其背景极其低，这一筛选报告子由于单一的营养缺陷报告子。
2） HIS3
Y2HGold菌株不能合成组氨酸，从而无法在缺少这一必须氨基酸的培养基上生长。当诱饵和诱捕蛋白相互作用，Gal4反应性的His3表达促使细胞合成组氨酸并能在His缺陷培养基上生长。
3） ADE2
Y2HGold菌株无法在不含腺嘌呤的基本培养基上生长，但当两个蛋白相互作用，Ade2表达被活化，细胞能在Ade缺陷的基础培养基上生长。
4） MEL1
MEL1编码α-半乳糖苷酶，存在许多酵母菌内的天然表达蛋白。当双杂交发生，MEL1表达和分泌，在底物X-α-Gal（货号：M5831-100mg）存在的情况下，酵母菌落变为蓝色。
三、三个不同的结合位点（three different binding sites）
Y2HGold菌株三个启动子控制4个报告基因是不相关的，除UAS区域的短蛋白结合位点特异性结合Gal4 DNA-BD。因此，诱捕蛋白（文库蛋白或靶蛋白）与UAS内部或边缘的不相关序列作用（假阳性）就会自动被筛查出来。
Matchmarker酵母菌株的报告基因构造。Y2HGold中，HIS3，ADE2，MEL1，和AUR1-C报告基因分别由三个完全异源的Gal4反应启动元件-G1，G2，M1操控。而启动子内的蛋白结合位点是不同的，虽然每一个结合位点与Gal4识别的17-mer共有序列相关联。
酵母双杂交系统操作流程（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）
完整的Matchmarker筛选过程包含以下步骤：
第一步：执行对照实验；
第二步：诱饵载体的构建及自我激活和毒性检测；
第三步：筛选Mate&Plate文库
第四步：确认和阐释结果
X-α-Gal优势：
避开双杂交分析中β-半乳糖苷酶溶液制备和滤膜提升实验（filter-lift assay）的繁琐操作，只需直接添加在培养基上，通过蓝色沉淀的生成与否，即可用来检测双杂交相互作用。
缺点：
成本高
HIS3报告基因启动后，酵母可以在组氨酸确实的平板上生长；ADE2报告基因启动后，酵母可以在腺嘌呤（adenine）缺失的平板上生长；lacZ和MEL1报告基因是平行的，两个基因上游都是由MEL1 UAS和MEL1 TATA区域同时控制的，区别在于lacZ的产物是β-半乳糖苷酶，其底物是X-gal；而MEL1的产物是a-半乳糖苷酶，其底物是X-a-gal。考虑到成本，我们可以在LWH平板中加入X-gal来进行筛选，其效果与X-a-gal是相同的。因此由三种UAS共同调控的AH109系统可以较好地排除假阳性，并且也能检测结合强弱。
X-α-Gal与酵母双杂交系统：
酵母双杂交筛选是体内用来检测蛋白-蛋白相互作用的一种遗传分析实验，此方法由Prof. Stan Fields及合作者开发用来调查两个已知蛋白的相互作用，另一个重要应用是从文库内筛选并鉴定某一特定蛋白的未知结合蛋白。阳性克隆也就是那些能够激活报告基因转录子，使得营养缺陷型酵母双杂交菌株在营养缺陷选择性培养基上生长的菌落。大多数双杂交方法使用大肠杆菌的LacZ基因作为第二个报告基因，通常要使用非常耗时的filter-lift assay来鉴定能在第二种选择性平板上生长的菌落。而替换使用的X-α-Gal，可直接在营养缺陷性的选择培养基上来检测基于GAL4-转录子的双杂交作用。
基本特性：
1）CAS NO：107021-38-5
2）化学名：5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷；X-α-D-Galactoside X-α-D-半乳糖苷；
3）分子式：C14H15BrClNO6
4） 分子量：408.64g/mol
5） 纯度：≥98%（TLC）
6） 外观：白色或近白色结晶粉末。
运输与保存方法
冰袋运输。-20 ºC保存。
携带MEL1基因的酵母菌株：
Y2HGold、Y190、AH190、Y187、PG69-2A
X-Gal与X-α-gal不同：
X-Gal是E.coli β-半乳糖苷酶（LacZ）的反应底物，而X-α-gal是酵母α-半乳糖苷酶（MEL1）的反应底物。X-α-gal用作酵母双杂交系统中蓝白筛选的筛选标记。
http://www.warbio.cn/rczp/show-1078.html
