胚胎干细胞向造血系统各类型细胞的分化

1 红细胞(erythroid)
 
红细胞是血液中数量最多的血细胞, 人体内每秒可以产生约2.4×106 红细胞。MEP在生长因子的刺激下形成集落红系祖细胞(burst forming uniterythroid, BFU-E), BFU-E继续分化形成红系祖细胞(colony forming unit, CFU-E), CFU-E分化成红细胞前体细胞(Pro-EB), Pro-EB在经过晚幼红细胞 (orthochromatic normoblasts, ON)和网织状红细胞 (reticulocytes)去核之后形成成熟的红细胞。1993年, Wiles实验室通过EB分化实验得到了成熟的小鼠红细胞。在ESC分化培养后的8天得到的EB加入细胞因子促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)和KL(KitLigand)继续培养10到14天得到了大部分红细胞的克隆。1997-1999年, Lindern和Wessely等陆续报道了人工合成的类糖皮质激素地塞米松(dexamethasone) 在红细胞前体细胞的自我更新过程中发挥重要作用。2004年, Beug实验室通过三步法将EB分化得到的红细胞前体细胞扩增到107倍。在人体中, 2006 年, Chang等通过EB分化将人的ES细胞系(H1)分化成红细胞, 当对这类细胞血红蛋白进行分析时, 发现它们表达胚胎期的ε型和胎儿期的γ型珠蛋白, 几乎不表达成人的β型珠蛋白。随后Lu等更进一步得到了表达成人型β珠蛋白的红细胞, 这类红细胞具有携氧能力, 可以达到1010 -1011 /6孔板, 从而初步实现了将人的ESC较大规模地分化为成熟具有功能的红细胞。此外, 2011年, Giarratana等在体外由CD34+ HSC得到分化的红细胞注射入NOD-SCID 小鼠体内, 完成了到成熟红细胞的转变。此外, 许多关键的转录因子在红细胞形成过程中发挥着重要作用, 例如GATA-1在红细胞巨核细胞、肥大细胞中均有表达, 在红细胞形成过程中一直伴随着GATA-1的表达, GATA-1基因敲除小鼠因为严重贫血在胚胎10.5至11.5天时死亡。GATA-1可以通过上调抗凋亡基因Bcl-xL来促进红细胞的成熟, 同时 GATA-1还可以与其他转录因子如FOG-1、EKLF、 TAL-1/SCL、PU.1和共转录因子CBP/p300、Brg1、MeCP1/NuRD等共同作用, 参与调节红细胞形成。此外, GATA-1还促进了CMP向MEP的分化过程。
 
2 巨核细胞(megakaryocytes)和血小板(platelets)
 
由于红细胞和巨核细胞都是由相同的前体细胞分化而来, 因此ESC向巨核细胞的分化与向红细胞的分化紧密相关。在红细胞分化过程中起到关键作用的转录因子GATA-1在巨核细胞形成血小板(platelets)过程也起了重要作用; 另外, 转录因子FOG(friend of Gata-1)也同时在红细胞和巨核细胞中表达。在整个分化过程中, FOG抑制红细胞的产生, 而在巨核细胞中FOG早期会抑制巨核细胞的形成, 在分化后期则会促进巨核细胞的形成。2003年, Fujimoto等报道了通过小鼠ESC与OP9细胞共培养使得ESC分化为巨核细胞, 并得到了成熟的血小板。他们将在α-MEM培养5天的ESC转移到OP9细胞上继续共培养, 在细胞因子(thrombopoietin, TPO) 的存在下, 观察到在第8~9天和第13~16天有两批血小板的产生, 这与原始造血(primitive hematopoiesis) 和永久造血(definitive hematopoiesis)相一致。另外, 2006年, Gaur等首次实现了用人的hES细胞通过 OP9共培养得到巨核细胞, 这些细胞表达巨核细胞的特异性标志物如: CD41a、CD42b等, 因此这个系统为研究巨核细胞形成以及整合素αIIβ3信号通路提供了理想的模型, 但是并没有检测到血小板的释放。2008年, Takayama等改进了实验设计, 他们利用人的ESC在C3H10T1/2基质细胞上面培养, 同时加上内皮细胞生长因子(vascular endothelial growthfactor, VEGF)使得分化细胞外围形成一个囊状结构, 利用这个囊状结构提供的微环境在IL-6、IL-11 以及干细胞生长因子(stem cell factor, SCF)和TPO细胞因子作用下得到了巨核细胞, 并且有表达CD41a 和CD61特异性标志物的血小板释放, 这些血小板亦可以被ADP和凝血酶激活, 略有遗憾的是这种方法得到的巨核细胞释放的血小板的量比较少。此外, 2010年Takayama等将人的真皮细胞重编程得到iPS细胞, 在与之前相同的实验条件下得到了之前 2~3倍数量的巨核细胞和血小板, 将得到的血小板移植入NOD-SCID-IL2rγ–/– 小鼠体内后, 在循环血液中检测到了血小板。同时通过活体成像显示这些血小板参与了血痂形成, 从而证明了分化得到的血小板在体内具有功能, 从而为临床治疗提供了直接的实验证据。
 
3 肥大细胞(mast cell)
 
肥大细胞是先天免疫和获得性免疫中IgE相关过敏反应的重要效应细胞。1991年, Wiles等和Keller等两人首先提出了两步法将分化15天的EB转移到含有IL-3的IMDM培养基中, 但是该分化体系中含有巨噬细胞。随后, Keller做出改进, 加入细胞因子KL、SCF、IL-3以及IL-1, 得到的细胞含有50%~60%的肥大细胞前体细胞, 并通过MayGriinwald-Giemsa和甲苯胺蓝染色确定肥大细胞的形成。Tsai等将ESC加入含有IL-11和SCF的甲基纤维素培养基中形成EB, 之后再把EB转移到含有 SCF和IL-3的培养基中, 分化六周可以由2 000个ESC 得到大约108 的肥大细胞。通过对这些ES来源的肥大细胞和骨髓来源的肥大细胞比较, 发现ES来源的肥大细胞无论生存能力还是在IgE依赖性的免疫反应中所发挥的作用, 都与骨髓来源的肥大细胞相同。
 
4 巨噬细胞(macrophages MФ)
 
巨噬细胞是先天性免疫中的重要效应细胞。 Moore等将传代2-3次的ESC加入含有CSF-1和 IL-3的IMDM甲基纤维素培养基中, 10~12天形成EB, 再转移到含有SCF和IL-3的培养基中培养, 4-5 天后可以看到附着在壁上的巨噬细胞。此外, Wiles等将分化了15天的EB转移到甲基纤维素膜IMDM培养基中, 在IL-3和M-CSF两种细胞因子存在下, 得到巨噬细胞, 并且通过形态学、May-GriinwaldGiemsa染色以及F4/80抗体鉴定。此外, IL-1的存在也可以将EB分化为巨噬细胞的概率由5%~10%提高到30%。后来, Lindmark等通过ES分化得到巨噬细胞, 与小鼠腹腔来源的巨噬细胞以及巨噬细胞系的基因表达谱做对比, 发现ES来源的巨噬细胞更接近于腹腔的巨噬细胞。2009年, Choi等分化得到了人的巨噬细胞, 他们将人的ESC和iPS与OP9共培养后, 分选出髓系单核细胞, 扩增后加入M-SCF和 IL-1β继续培养5~7天, 所得到的巨噬细胞无论是形态、表面分子标记物还是功能均与组织来源的巨噬细胞相似。
 
5 B淋巴细胞
 
B淋巴细胞的发生是在从原始造血的卵黄囊转移到胚肝中才开始的。Nakano等早在提出OP9培养系统时就已经把ESC分化到了前体B细胞, 但是只有一小部分能分化成IgM阳性的B细胞。随后, Cho等做出改进, 在将ESC与OP9共培养后, 在细胞因子IL-7和Flt-3L(Flt-3 ligand)存在下分化成B淋巴细胞, 并且证明了由ES分化得到的B淋巴细胞与胚肝或骨髓来源的B淋巴细胞非常相似, 都可以与Flt-3L 反应, 都可以被阿贝尔森小鼠白血病病毒所感染, 在脂多糖刺激时均可以分泌抗体。2011年, Carpenter 等首次报道了利用人的iPS细胞用OP9或MS-5基质细胞共培养得到了表达CD45+ 、CD19+ 、CD10+ 的B细胞前体细胞, 尽管他们不表达IgM和CD5分子, 但的确发生了D-J(H)区的基因重排。
 
6 T淋巴细胞
 
与B细胞不同, T淋巴细胞是在胸腺中发育成熟的, 而且T淋巴细胞的成熟与胸腺的环境紧密相关, 因此体外分化T淋巴细胞相对比较困难。de Pooter等发现, 小鼠的ESC分化得到的Flk1+、CD45-的前体细胞移植到胸腺器官后培养能得到T淋巴细胞。此外, 他们还发现, Notch信号通路在体外诱导HSC 向T淋巴细胞分化过程中有着重要作用 , 所以采用了表达Notch信号通路的配体Delta-Like1(DL1)的基质细胞(OP9-DL1)与ESC共培养, 14天后可以看到表达T淋巴细胞谱系特异性标志物CD25和CD44的细胞, 而且体外培养的T淋巴细胞也经历了与体内相同的从CD4– 、CD8– 双阴T淋巴细胞(double negative) 向CD4+ 、CD8+ 双阳T淋巴细胞(double positive)发育的过程。2006年, Galic等报道了用人的ES细胞系H1与小鼠的基质细胞共培养, 然后分选出CD34+ 和CD133+ 细胞移植到免疫缺陷型的人源化小鼠体内, 检测到了分化出的T淋巴细胞。当用抗CD3和抗CD28抗体激活后, 这些细胞可以表达T细胞激活后的特异性标记分子, 显示这些由ES分化得到的T细胞是有功能的。