大小鼠全身性灌注固定组织法

啮齿动物固定的目的是为了快速且均匀地将组织保持于特定的生存状态。虽然将组织直接放置在固定液中可以很好地用于小块组织的固定。但是像完整大脑，心脏这样的较大样本会引起浸入式固定的问题，因为固定液并不会以相同的速率到达组织的所有区域，而组织往往在固定液进入前即发生缺氧反应。利用循环系统直接灌注固定液的优点是化学物质可以使用天然的血管网络系统快速到达生物体的各个角落以达到整体固定的效果。我们寻找的方式就是介绍一种低成本，快速，可控和统一的固定方法，使用4％多聚甲醛通过血管系统灌注以获得大鼠大脑最好的固定。此方法视频由密歇根大学生物医学工程系Gregory J. Gage等人制作。

以下为具体实验方法：

1.准备固定液

2.准备灌注缓冲液

3.准备仪器和麻醉

3.1通过水浴加温将灌注缓冲液加温至37°C。将出口阀放入装有缓冲液的烧杯中。用缓冲液填充50 ml注射器并连接到固定管。通过排出缓冲液反复冲洗管道。

 

3.2用缓冲液反复冲洗管道。直到管道中的所有气泡都被排出。

3.3取下注射器并连接4％多聚甲醛固定液（室温）容器。为了避免管端处的气泡，在将管定位到容器中的同时挤压管排出气泡。

3.4关闭出口（针头端）。将缓冲阀（蓝色）转到与固定阀（白色）相同的位置。使缓冲液得以流出。

 

3.5打开出口端口并重复步骤3.1至3.3以填充缓冲液。并消除所有气泡。

3.6利用橡胶泵使测试系统中保持灌注所需的一定压力。

3.7在系统中安装所需设备，方便操作。

 

3.8在手术之前，通过腹膜内注射（给予氯胺酮/甲苯噻嗪混合物维持麻醉。

4.手术灌注

4.1一旦动物到达手术所需的麻醉程度，将其放在装满碎冰的浅盘上。

4.2在肋骨下方的体表和腹壁做一个5-6厘米的侧切口。小心地将肝脏与隔膜分开。

4.3使用弯曲的钝剪刀在隔膜上做一个小切口。

4.4沿着肋骨的整个长度继续隔膜切口以暴露胸膜腔。
4.5沿着肋骨的一侧放置弯曲的钝剪刀，小心地移动肺部，并通过肋骨切割至锁骨。在对侧进行类似的切割。
4.6抬起胸骨，仔细修剪连接心脏的组织。用止血钳夹住胸骨尖端，将止血钳放在头上。

 

4.7使用虹膜剪刀在左心室后端做一个小切口。

4.8将15号钝头或橄榄尖灌注针穿过切开的心室进入升主动脉。

4.9使用止血钳夹住心脏，这可以固定针头并防止泄漏。

4.10使用虹膜剪刀在动物的右心房切开，以尽可能大的出口，而不会损坏降主动脉。此时动物即准备好灌注。

5.灌注

5.1打开灌注系统并将出口连接到针座，注意不要引入任何气泡。

5.2将压力计显示压力快速均匀地抽吸至80mm Hg。

5.3调整针角以实现最大流速。

 

5.4一旦缓冲液灌注几乎完成（200毫升），切换缓冲阀（蓝色）至固定液。

5.5当固定开始几秒钟内可观察到固定震颤，即为固定开始。

5.6压力逐渐增加至最大130 mm Hg，以保持稳定的流速。

 

5.7一旦固定液接近完成，关闭出口阀。完成灌注。

5.8完成灌注后，大鼠应为僵硬状态。

5.9根据要求处理所用缓冲液及灌注液。

6.解剖

6.1利用剪刀取下头部。

 

6.2从颈部到鼻子沿着体表做一个中线切口，露出颅骨。
6.3修剪剩下的颈部肌肉，露出颅底;使用剪刀或咬骨钳去除任何残留的肌肉。

6.4将一把虹膜剪刀的尖端放在一侧的枕骨大孔上，小心地沿着头骨的内表面滑动剪刀。
6.5切割延伸到后颅骨表面的远端边缘。在对侧进行相同的切割。使用咬骨钳清除小脑周围的头骨。
6.6当尖端从背侧远端后角移动到颅骨的远端前缘时，小心地沿着颅骨内表面滑动剪刀，在切割时抬起刀片以防止损坏大脑。
6.7使用咬骨钳将颅骨的背面剥离远离大脑。使用咬骨钳修剪头骨的两侧。
6.8使用刮刀，切断嗅球和沿大脑腹面的神经连接。

6.9轻轻地将大脑从头部取出，修剪大脑连接到头骨的硬骨膜。
6.10取出大脑并将其放入一瓶含有至少10倍于大脑本身体积的固定液中。并适时地转动小瓶。

7.后固定及储存

7.1将大脑置于4°C固定液中24小时并适时转动。

7.2 24小时后用3倍存储液的磷酸盐缓冲液清洗大脑并适时转动。

7.3可将脑保存在4°C磷酸盐缓冲液或含有叠氮化钠的HBHS中。

8.灌注效果

 

灌注成功的最初指标是实验动物的四肢的颜色及僵硬度。大脑的大体检查显示血管无血液。在用于染色和组织切片中也是如此。灌注结果的最终指标是组织中超微结构的状况。