使用Agilent Femto Pulse系统对用于生物样本库样品的基因组DNA进行质量评估

作者
Chava Pocernich，Jolita Uthe，Steve Siembieda 安捷伦科技有限公司

摘要
核酸样品的质量保证和质量控制对于生物样本库和进行基因组相关操作的实验室以及多种分子生物学应用必不可少。革命性的 Agilent Femto Pulse 系统是唯一一款能够替代脉冲场凝胶电泳分析高分子量 (HMW) gDNA 的仪器。Femto Pulse 系统为研究人员提供了极高的灵敏度和快速的分离时间，能够在 70 分钟内对单个细胞量的 gDNA 进行定量和鉴定。安捷伦基因组 DNA 165 kb 试剂盒设计用于分离 HMW gDNA，可实现可重现的分子量测定、定量分析和基于基因组质量值 (GQN) 的质量控制评估。

前言
DNA 完整性的表征对于生物样本库质量控制评估至关重要。了解基因组 DNA (gDNA) 质量是 DNA 完整性的独特价值， 并对下游过程的成功必不可少。随着人们对长读长和全基因组测序技术、比较基因组杂交以及使用 linked reads 的序列组装技术的兴趣日益增加，了解 gDNA 质量、片段化、分子量分布和浓度成为了成功获得结果的必要条件。

通过确定样品的片段化和降解程度，部分评估 gDNA 质量。影响样品质量的几个因素有：样品储存、提取方法、反复冻融和变性^[1]。在提取和处理 gDNA 期间，DNA 可以在许多不同位点发生物理、酶促和化学剪切，变为小片段。物理剪切发生在长时间的剧烈混合条件下，以及反复冻融和冰晶形成期间。DNA 周围细胞环境的破坏将通过自由基氧化、脱嘌呤和 gDNA 的核酸酶降解引发酶促和化学剪切，导致一系列短片段的生成。在使用高强度化学品提取 DNA 时也可能发生化学剪切。用大口径移液枪头缓慢混合可以防止 gDNA 物理剪切，而通过冷冻、脱水或添加螯合剂（如 EDTA）可避免化学和酶促剪切过程。考虑到 DNA 完整性会以多种方式发生改变，建议在长期储存 gDNA 样品之前记录核酸质量。

通常用过夜脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 分析分子量超过 50 kb 的 gDNA。配备安捷伦基因组 DNA 165 kb 试剂盒的 Agilent Femto Pulse 系统是市场上唯一能够替代 PFGE 评估高分子量 (HMW) gDNA 的解决方案。分离过程在短短 70 分钟内完成，节省了确定样品质量所需的时间和金钱^[2]。此外，安捷伦设计的 ProSize 数据分析软件可以通过基因组质量值轻松分析 gDNA  质量。用户可针对其特定应用设定合适的分子量阈值。然后，ProSize 根据高于分子量阈值的样品总测量浓度分数计算 GQN 值。GQN 以 0 到 10 的等级对样品进行评分，0 表示样品均未超过分子量阈值，10 表示 100% 的样品高于分子量阈值。

实验部分
在配备基因组 DNA 165 kb 试剂盒 (FP- 1002-0275) 的两台不同 Femto Pulse 系统上分离 40 号（gDNA 样品 1）和 92 号（gDNA 样品 2）Coriell 样品，以证明仪器间一致性以及随时间推移的降解程度。在配备安捷伦基因组 DNA 165 kb 试剂盒的 Femto Pulse 系统上对来自 PacBio 的剪切 gDNA 进行分离，以展示 GQN 指标的灵活性。在配备基因组 DNA 165 kb 试剂盒的 Femto Pulse 系统上对 Promega 人 gDNA (#G1521) 进行分离，以显示峰大小和特征片段长度。

结果与讨论
分子量测定
Femto Pulse 系统利用脉冲场方法分离高分子量 gDNA，用于确定大于 50 kb 的 gDNA 的平均分子量。此外，电泳图提供了直观的样品分子量分布图。在不使用脉冲场方法的情况下，大于约 50 kb 的样品显示为尖峰且测定分子量超过 60 kb。在配备基因组 DNA 165 kb 试剂盒的 Femto Pulse 系统上分析 gDNA 样品 1，弥散条带平均分子量为 44800 bp，分布在 1200 到 300000 bp 之间（图 1）。



仪器间的一致性
在配备安捷伦基因组 DNA 165 kb 试剂盒的 Femto Pulse 系统上分析两种不同的 gDNA 样品。在两台不同的 Femto Pulse 仪器上对几种浓度下的两个样品进行了分析，以证明较大浓度范围内不同仪器之间的分子量测定、浓度定量和 gDNA 质量分析的可靠性与一致性（图 2）。每台仪器各稀释比例的分子量测定和定量分析精度（误差）分别低于 8% 和 16%，均处于试剂盒的规格范围内。此外，GQN 证明仪器有极高精度，CV 为 3%。



基因组质量值 (GQN)
GQN 用数值表示 gDNA 质量，代表了高于分子量阈值样品的比例。高度完整的 gDNA 的分子量会随包括物种在内的许多因素而变化。因此，在需要分析不同分子量的 gDNA 时，能设置 GQN 分子量阈值是一项巨大的优势。用户可以根据具体样品确定分子量阈值，以便客观判断哪些样品可用于下游操作。

根据 gDNA 样品 A 和 B 的分子量分布， 将 GQN 分子量阈值设定为 10000 bp。GQN 在不同稀释比例组中保持一致，数值集中在 9.0 至 8.8 之间（图 2）。GQN 9.0 表示高于 10000 bp 阈值的样品占90%。也就是说，有 10% 的样品低于阈值水平。随着时间的推移，样品 GQN 的降低表明已经发生了降解。

在图 3 中，将剪切 gDNA PacBio 样品的 GQN 分子量阈值设为 30000 bp，表明评价 gDNA 质量时 GQN 的灵活性。30000 bp 的分子量阈值得到的低分子量样品的 GQN 值低于高分子量样品，与GQN 随分子量不同而变化的预期一致。



降解检测
Femto Pulse 系统可以检出轻微程度的降解，并反映在 GQN 中。制备好 gDNA 样品 1 的样品板后立即分析，然后在室温下放置 3 天后再次分析。Femto Pulse 系统分离显示样品 1 出现了明显降解，在原gDNA 条带前方出现小弥散条带，平均分子量从 44.8 kb 减小至 34.5 kb（图 4）。



GQN₁₀₀₀₀ 从 9.1 降至 8.4，也反映出降解的存在。ProSize 还允许用户在 Smear Analysis 选项卡中选择碱基对范围，从而检测低分子量区域中的样品降解百分比。样品 1 的降解范围选择为 200 至 1200 bp。该范围包括紧邻原样品条带的前方区域，同时排除了下位内标。室温环境放置使降解百分比从 0.1% 升高至 1.4%（图 4）。这也被称为“小于 X kb”的弥散条带比 (SR)^[1]。弥散条带比提供了因冻融或化学降解而片段化的 DNA 比例估计值。


特征片段长度 (CFL)
特征片段长度 (CFL) 对应于样品中丰度最高的片段^[3]。在 ProSize 中，将其报告为峰分子量。在用凝胶电泳评估 DNA 完整性时，CFL 是常规报告参数。CFL 的减少变化容易检出，并可作为物理剪切引起降解的指标。在配备安捷伦基因组DNA 165 kb 试剂盒的 Femto Pulse 系统上分析 Promega 人 gDNA。电泳图显示出 175685 bp 的尖峰，对应为样品的 CFL（图 5）。并非所有样品都能显示出明确的 CFL，如图 1 所示。在这种情况下，可以利用平均分子量的变化追踪降解，而不是用最大丰度峰分子量或CFL。



结论
随着人们对长读长和全基因组测序技术的兴趣日益增加，HMW gDNA 质量的记录变得越来越重要。Femto Pulse 系统是唯一一款能够替代脉冲场凝胶电泳， 在 70 分钟内分析分子量超过 60 kb 的HMW gDNA 的仪器，检测限低至单个细胞的 DNA 量。在 Femto Pulse 系统中利用 GQN、平均分子量或特征片段长度变化，以及低分子量弥散条带区域的增加， 可轻松对gDNA 降解进行评估。

参考文献
1. Klingstrom, T.; Bongcam-Rudloff, E.; Pettersson, O. V. A Comprehensive Model of DNA Fragmentation for the Preservation of High Molecular Weight DNA. BioRxiv: The Preprint Server for Biology 2018
2. Pocernich, C.; Uthe, J.; Wong, K-S. Genomic DNA Sizing and Quality Control with the Agilent Femto Pulse System（利用 Agilent Femto Pulse 系统进行基因组DNA 分子量测定与质量控制），安捷伦科技公司应用简报，出版号 5994-0516EN，2017
3. Cinselli, C. W.; et al. Combining Qualitative and Quantitative Imaging Evaluation for Assessment of Genomic DNA Integrity: The SPIDA Experience. Anal. Biochem. 2015, 479, 60–62

^{仅限研究使用。不可用于诊断目的。
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2019 年 2 月 14 日，中国出版
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