western blot实验中印迹膜和凝胶出现的问题及解决方案

Western blot是生物化学和免疫遗传学中常用的一种蛋白分析方法，其技术环节多，操作时间长，哪一步出现问题，都会影响最后的结果，今天小编总结了WB中印迹膜和凝胶中出现的问题及解决方案，希望可以帮助在WB中苦恼的小伙伴。 问题：波浪式的环绕条带
引起原因：转印不均匀
解决方法：当组装三明治结构时，要确保转印堆叠各部分紧密地连接在一起。可能需要更换海绵垫，以达到适合的松紧度。
  问题:条带是波浪型的，微笑的，歪斜的
引起原因：
1.在样本中可能有细胞碎片或者DNA
2.上样buffer不新鲜或者含有太多盐成分。
3.运行凝胶太快，导致凝胶升温，降解聚合物。
解决方法：
1.增加超声步骤
2.延长加热时间
3.离心
4.尝试准备新鲜的缓冲液，使用不同类型的缓冲液，或通过稀释、透析/微透析或色谱法降低样品缓冲液的盐浓度。
6.选择适当的缓冲液
 7.设置适当的电流并保持低电压

 
问题：泳道内有多个蛋白条带
引起原因：
1.封闭不完全
2.一抗特异性低
3.一抗浓度过高
解决方法：
1.更换封闭液。许多常用的封闭液可能屏蔽目标上的表位，使其难以检测。封闭不完全，非特异性结合到不相关的裂解蛋白。用商业的封闭剂代替牛奶可以减少非特异性结合，同时增强抗体与抗原的相互作用。
2.纯化一抗或者更换抗体
3.增加一抗的稀释比例或者孵育时间，4度孵育可以减少非特异性结合 问题：剥离的印迹膜仍有条带
引起原因：剥离不完全
解决方法：
1.优化剥离条件，增加剥离时间，需要确保印迹膜完全淹没在剥离缓冲液中，并在摇床上充分摇动。
2.另一个需要考虑的解决方案是使用荧光标记的二抗进行多重Western blot。使用荧光检测，您可以检测多达四种不同的信号，这取决于您的检测系统。
  问题：气泡
引起原因：
1.膜和凝胶之间有气泡。
2.一抗与印迹接触不足。
解决方法：
1.当进行三明治组装时，要注意完全清除印迹膜和凝胶之间的空气。使用玻璃棒或塑料吸管轻轻地把夹在印迹膜薄膜和凝胶之间的空气挤出来。
2.增加一抗孵育液的体积，并在孵育步骤中验证溶液是否完全覆盖膜。孵育盘应该足够大，使印迹膜可以移动.

 
问题：高背景
引起原因：
1.封闭不充分
2.漂洗不充分
2. 一抗浓度过高
解决方法：
1.更换封闭液。许多常用的封闭液可能屏蔽目标上的表位，使其难以检测。封闭不完全，非特异性结合到不相关的裂解蛋白。用商业的封闭剂代替牛奶可以减少非特异性结合，同时增强抗体与抗原的相互作用。
2.增加漂洗次数或洗涤时间。此外，增加漂洗剂的用量或使用更强的漂洗剂，如SDS或NP-40，可以进一步降低背景。
3.增加一抗的稀释或增加孵育时间，如果必要，4°C孵育可减少非特异性抗体的结合。

 
问题：荧光western blot的高背景
引起原因：
1.NC膜和某些类型的PVDF膜有自发荧光，导致高背景信号。
2. 湿膜成像
3. 一抗浓度过高导致高背景
4. 漂洗不充分
解决方法：
1.使用低荧光背景膜
2.成像前用甲醇将膜干燥。当印迹膜干时，膜上的自发荧光减少，荧光基团发出的特异性信号变亮
3.增加一抗的稀释或增加孵育时间，如果必要，4°C孵育可减少非特异性抗体的结合
4.增加漂洗次数或洗涤时间。此外，增加漂洗剂的用量或使用更强的漂洗剂，如SDS或NP-40，可以进一步降低背景。 问题：Marker太亮
引起原因：Marker上样量太多
解决方法：
1.增加Marker的稀释。大多数Marker在IR 700通道内有自发荧光，这便于在荧光western blot中测定条带的分子量。然而，如果你已经习惯了使用化学发光Western blot，那么你的Marker可能上样量过多——我们建议在荧光Western blot上使用大约十分之一的分子量marker。
2.我们建议用非荧光的、干净的、不透明的材料覆盖强条带。