不同品牌游离核酸保存管的比较
1.前言
循环游离核酸(circulating cell-free nucleic acids)是指存在于人体循环系统中，游离于细胞外的微量内源性或外源性核酸片段，包括核DNA、线粒体DNA(mitochondrial DNA，mitDNA)、病毒DNA、信使RNA(messenger RNA， mRNA)及微小RNA(microRNA， miRNA)等。 1948年， Mandel等［1］ 首次发现了血液循环中游离DNA的存在。随后，循环游离核酸在病理状态下的特异性变化引起了广泛关注。虽然这一发现十分重大，但当时并未引起人们的广泛关注，并且在此后的很长一段时间里，人们也仅局限于研究游离 DNA 与人类自身免疫病之间的关系。 1975 年， Steinman 在健康人的血浆中也发现有游离形式的核酸存在，这提示我们这种核酸的出现属于病理学事件，而非病因学事件，但健康人血浆中游离 DNA 的量要显著低于患有一定疾病的人。 1977年， Leon等［2］ 发现肿瘤患者血清中的游离DNA水平较健康人群明显升高，并与肿瘤的进展与预后相关。 1997年，人们发现在孕妇血浆中含有游离形式的胎儿源的 DNA，这使得血浆游离核酸的研究在胎儿出生前诊断方面的应用也有了快速的发展。 1989年， Stroun等［3］ 发现肿瘤患者血液中的游离核酸含有与肿瘤细胞相同的基因突变。现如今，游离核酸与肿瘤、妊娠相关性疾病、自身免疫病、移植排斥反应、创伤、急救医学等有着密切关系，其检测对疾病的早期诊断、分期、监测、预后判断等有重要意义。
鉴于游离核酸的重要检测意义，游离核酸的保存条件则直接决定了检测结果的可靠性。为确保游离核酸标本检测的准确性， 本文采用了市面上常用的不同品牌游离核酸保存管，就保存效果进行了比较。
2 材料与方法
2. 1 材料
2.1.1 保存管及分组
（1） E 组：普通抗凝采血管（主要成分 EDTA·2Na）；
（2） S 组： Cell-Free DNA BCT（品牌： S 公司， REF.2***52）；
（3） B 组： Cell-Free DNA Storage Tube 10mL(品牌：百泰克， REF. ST2001)；
（4） K 组： Cell-Free DNA Storage Tube 10mL（品牌： K 公司， Cat. CW***6S）。2.1.2 血液样本
健康人血 10ml。
2.1.3 试剂及设备
（1） Premix EX Taq （TaKaRa,Cat.RR390A）；
（2）探针及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；
（3） Qubit dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen by Thermo Fisher Scientific）；
（4） Beta-actin 质粒由上海捷瑞生物工程有限公司合成；
（5） BioRad-CFX96(BIO-RAD, Foster city, California， USA）， Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies， USA)， Mili-Q Advantage A10， SHZ-82A 恒温振荡器（常州医疗器件厂） 。
2.2 方法
2.2.1 血液样本采集
采用标准静脉穿刺采集年龄 22-40 岁健康人血 10ml，各组年龄差异无统计学意义（P＜0.05） ，分别装于采血管及保存管。
2.2.2 血浆分离方法
轻柔上下颠倒混匀 10 次， 800×g， 20min，转移上层血浆至 1.5ml 离心管； 16,000×g，室温， 10min，转移上层血浆至 1.5ml 离心管冻存-80℃备用。提取游离核酸前，室温解冻，16,000×g， 5min，吸取上层血浆，进行游离核酸提取。
2.2.3 游离核酸提取方法
根据 QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook 试剂盒操作说明操作。
2.2.4 Qubit 荧光计定量血浆游离 DNA 的浓度
采用 Qubit 2.0 荧光计定量血浆游离 DNA 的浓度。
2.2.5 Beta-actin 拷贝数的检测
Beta-actin 10 倍梯度稀释 107-101，引物分别分 actin-F1， actin-R1，探针为 probe actin，引物及探针工作浓度为 5 uM， 20ul 荧光定量体系引物加入量为各 1ul。扩增程序为 50° C、 5min， 95° C、 10min，循环 50 次， 95° C、 20s， 65° C、 20s，72° C、 10min， 结束。
扩增程序试剂组成：
Reagent 体积（ul）
Takara Premix 10
Primer F 1
Primer R 1
Probe 1
模板 1
ddH2O 补足 20ul
3 结果
3.1 不同天数下（25°C）游离核酸保存效果的对比
分别用 3 种不同的保存管（E、 S 及 B）采集血液 10ml，颠倒混匀 15 次后立即等分 4份至无抗凝剂无促凝剂的玻璃采血管中，保存条件为 25°C。分别于保存第 0、 3、 7、 14 天时分离血浆，提取游离核酸。
图 1 显示： 保存第 7 天和第 14 天， E 组出现明显的溶血现象，并随时间的延长更加严重；S 品牌产品保存的血液第 7 天略微有溶血现象，第 14 天时，溶血严重。相比之下， B 品牌产品效果较佳。
图2 显示： 25°C条件下， E产品在第0天时，基因组基本无释放； 第3、 7、 14天的核酸量随时间延长，基因组释放量增加明显； 第14天的核酸检测量是第0天的至少2500倍。 B产品的保存效果在14天之内，基本能够抑制基因组的释放； 第14天的检测结果为第0天的1.77倍。 S品牌产品7天之内，能够保持cfDNA稳定，基本无基因组释放；但第14天检测量剧增，是第0天的2200倍。
图 3 显示： Beta-actin 绝对定量结果趋势与 Qubit 结果基本一致，室温 25°C 保存 3 天， 3 种保存管的差异不显著；保存第 7 天时， E 与 B 组间的 P Value<0.01， 差异极显著， B 与 S 组 0.01
图 4Qubit 结果显示： 三种保存管 7 天内保存效果无明显差异， 14 天时， K 组与 S 组保存管均出现明显的上升，分别是第 0 天的 15.27 倍和 10.21 倍， 21 天时，上升最为明显，分别是第 0天的 22.46 倍和 13.84 倍。 B 组保护剂保存的血液在第 0、 3、 7、 14、 21、 28 天检测时， 每毫升血液 cf-DNA 浓度均无明显的上升。
图 5Beta-actin 绝对定量结果与图 4 基本一致。 B2 组保护剂保存的血液在第 0、 3、 7、 14、21、 28 天检测时， 每毫升血液 Beta-actin 拷贝数均无明显的上升。
3.2 不同天数下（4°C）游离核酸保存效果的对比
图 6Qubit 结果显示： 在 4°C 情况下， 三种保存管 0-14 天的每毫升血液 cf-DNA 浓度并无明显的差异。
图 7Beta-actin 结果显示：在 4°C 情况下，三种保存管 0-14 天的每毫升血液 Beta-actin 拷贝数并无明显的差异。
3.3 不同天数下（37°C）游离核酸保存效果的对比
图 8Qubit 结果显示：在 37°C 情况下，三种保存管 0-14 天的每毫升血液 cf-DNA 浓度并无明显的差异。
图 9Beta-actin 结果显示：在 37°C 情况下，三种保存管 0-14 天的每毫升血液 Beta-actin拷贝数并无明显的差异。
3.4 运输环境（25°C）对游离核酸保存效果的影响
考虑到保存管有可能应用于样品的长途或短途运输，因此需用摇床模拟运输环境对保护剂抑制细胞破裂的影响。 S 组、 K 组及 B 组分别采集血液一份，摇床设置 180rpm， 25°C，分别在 0、 3、 7、 14 天检测核酸浓度和 beta-actin 拷贝量。
图 10Qubit 结果显示：在 25°C 模拟震荡情况下，三种保存管 0-14 天的每毫升血液 cf-DNA浓度并无明显的差异。
图 11Beta-actin 结果显示：在 25°C 模拟震荡情况下，三种保存管 0-14 天的每毫升血液Beta-actin 拷贝数并无明显的差异。
4.讨论
（1）从每毫升血液 Beta-actin拷贝数及每毫升血液 cf-DNA浓度两个方面来验证 cf-DNA完整性，已在多篇文献中[4][5]得到验证。
（2） 室温 25°C 下，保存 3 天时， 3 种保存管的差异不显著；保存第 7 天时， E 与 B 组间的差异极显著， B 与 S 组差异具有显著性；保存第 14 天时， B 与 S 组 P value<0.01，差异极显著。 在室温 25°C 下， B 组较 S 组及 E 组，保存时间较长，效果较佳。
（3）室温 25°C 下，三种保存管 7 天内保存效果无明显差异， 14 天时， K 组与 S 组保存管均出现明显的上升，， 21 天时，上升最明显。 B 组保护剂保存的血液在第 0、 3、 7、 14、 21、 28 天检测时，每毫升血液 cf-DNA 浓度均无明显的上升。 在室温 25°C 下， B 组较 S 组及 K 组，保存时间较长，效果较佳。
（4）在 4°C 情况下，三种保存管 0-14 天的每毫升血液 Beta-actin 拷贝数及每毫升血液 cf-DNA浓度并无明显的差异。 在 4°C 下， B 组、 S 组及 K 组，保存效果无明显差异。
（5）在 37°C 情况下，三种保存管 0-14 天的每毫升血液 Beta-actin 拷贝数及每毫升血液 cf-DNA浓度并无明显的差异。 在 37°C 下， B 组、 S 组及 K 组，保存效果无明显差异。
（6） 在 25°C 模拟震荡情况下，三种保存管 0-14 天的每毫升血液 Beta-actin 拷贝数及每毫升血液cf-DNA 浓度并无明显的差异。 在 25°C 模拟震荡情况下， B 组、 S 组及 K 组，保存效果无明显差异。
5.参考文献
[1]MANDEL P, MéTAIS P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme ［J］ . C R Acad Sci Paris, 1948,142: 241-243.
[2]LEON S A, SHAPIRO B, SKLAROFF D M, et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy ［J］ .Cancer Res, 1977, 37(3): 646-750.
[3]STROUN M, ANKER P, MAURICE P, et al. Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients［J］ . Oncology, 1989, 46(5): 318-322.
[4]Norton S E, Lechner J M, Williams T, et al. A stabilizing reagent prevents cell-free DNA contamination by cellular DNA in plasma during blood sample storage and shipping as determined by digital PCR[J]. Clinical Biochemistry, 2013, 46(15):1561-5.
[5] Ryan W L, Fernando R M, Das K. BLOOD COLLECTION DEVICE FOR STABILIZING CELL-FREE PLASMA DNA:, WO 2013123030 A3[P]. 2013.
