使用SpectraMax多功能微孔板读板机进行cAMP HiRange检测
简介
在这篇应用文献中，我们展示了如何用SpectraMax®i3、SpectraMax®Paradigm®和SpectraMax®M5e多功能微孔板读板机进行可靠的、高通量的HTRF®检测，并具有完美的Z’因子和高重复性的EC50值。
HTRF®是CisbioBioassays公司开发的一项检测生物分子相互作用的多用途技术1。这项技术结合了荧光共振能量转移(FRET)技术和时间分辨(TR)荧光测定，可消除短寿命的背景荧光。这一检测使用供体和受体荧光基团。当供体和受体彼此足够接近时，能量源(如氙闪灯)激发供体使能量转移到受体上，受体发射出特定波长的荧光。
HTRF使用4种专门的荧光基团，能够组合成一对供体-受体TR-FRET基团。供体为铕(Eu3+)的穴状化合物和铽(Lumi4TM-Tb)的穴状化合物，其长寿命荧光可以用于时间分辨荧光检测中1。两种受体分别为XL665和d2，用于HTRF检测中。这两种受体的激发光谱均与HTRF供体的发射光谱重叠。每个受体的发射峰都在665nm且供体在这一范围内没有发射光或发射光很弱。最初的HTRF受体XL665，是一种从红藻中纯化出的藻胆蛋白色素。第二代受体d2是一种经过修饰的别藻蓝蛋白，比XL665小100倍且可以减少可能在XL665检测中出现的空间位阻问题。
HTRF cAMP HiRange试剂盒能够在细胞样品中对环腺苷酸(cAMP，环腺苷3’，5’ 一磷酸)进行定量。cAMP在G蛋白偶联受体(GPCR)信号转导中是一种关键的第二信使。当配体结合到GPCR，构想改变就会发生，激活受体接着激活G蛋白。进一步的信号转导取决于激活的G蛋白类型。Gs的激活导致腺苷酸环化酶调控cAMP的上调。细胞中产生的自由cAMP与d2-标记的cAMP竞争性结合抗cAMP穴状化合物抗体，因此，细胞内cAMP的增加会导致FRET降低，侦测到的665nm荧光发射也会下降(图 1)。
优势
- 高度可靠的均相实验
- Z’ 因子 ≥ 0.9
- 流程式且稳定的高通量(HTS)检测
- SoftMax Pro软件预设实验模板快速获得结果
材料
- cAMP HiRange 1000 测试
(Cisbio P/N 62AM6PEB)
- 黑色和白色低体积384-孔微孔板
(Greiner P/N 784076 和 784075)
- SpectraMax i3 多功能微孔板读板机
(Molecular Devices)
- SpectraMax Paradigm 多功能微孔板
读板机(Molecular Devices)
- SpectraMax M5e 多功能微孔板读板机
(Molecular Devices)
- HTRF 检测卡盒
(Molecular Devices P/N 0200-7011)
方法
HTRF cAMP HiRange试剂盒由CisbioBioassays公司提供。按照cAMP HiRangeHTRF药品说明书准备终浓度范围从0.17nM到2800 nM的cAMP标准品。不含cAMP的阳性质控(最大FRET)和不含cAMP或cAMP-d2的阴性质控包含在内。按照表1中所述，每孔添加20 μL试剂。
数据分析
使用Cisbio专利的基于双发射波长检测的比值算法分析HTRF检测。616nm发射波长的供体作为内参，同时665nm发射波长的受体作为测定生物学反应的指示。这种比例测定减少了孔与孔之间的差异并降低了化合物干扰。在第4步计算的Delta F反映了测定时的信号相对于背景大小，用于内部测定的比较。结果通过665 nm/616 nm比值计算，以如下Delta F表示：
Z’ 因子由阴性(无cAMP，无cAMP-d2)和阳性质控(无cAMP)计算得到2。
利用SoftMax® Pro软件生成和分析数据，包含一些预设的HTRF实验模板以简化检测和分析。
结果
使用SoftMax Pro软件的4-参数曲线拟合如上所述进行数据分析和做图。依据表2的读板机参数设置获得最佳结果。当延迟时间、整合时间和脉冲数增加，会观察到DF%的下降。与白色微孔板(图2)相比，使用黑色低体积384-孔微孔板可使检测窗从3020增加到3253。然而，Z’ 因子，考虑到阳性和阴性质控的检测窗和标准差以及EC 50值在两个孔板类型中非常相似(表3)。(注意：当使用SpectraMax M5e多功能微孔板读板机，需要白色孔板。)
SpectraMax i3和SpectraMax Paradigm读板机在逐一比较相同测试孔板时得到的结果基本一致(图3)。针对这一测试，利用了白色微孔板。检测窗为3004和3051，且Z’ 因子分别是0.92和0.90。EC50值是19.1nM，相比于发布值(表3)。SpectraMaxM5e多功能微孔板读板机得到相似的Z’因子和EC50值。
SpectraMax Paradigm读板机得益于双PMT配置而比其他读板机更快，使之可以同时读取两个HTRF发射波长(表3)。
总结
SpectraMaxi3和SpectraMaxParadigm读板机可配置具有高通量筛选能力且HTRF认证的检测卡盒。当在SpectraMaxParadigm读板机上使用时，此卡盒能进行双发射同时检测从而加快读数速度。在三个读板机中，cAMPHiRange测定得到的完美Z’因子表明了多功能检测系统的可靠性能。采用SoftMaxPro软件自带的HTRF预设实验模板大大简化了数据采集和分析。
参考
1. http://www.htrf.com/htrf-technology
2. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., and Oldenburg,K. R. (1999). A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of highthrough put screening assays J. Biomolecular Screening4(2): 67-73.
