酶标仪在蛋白质的相互作用验证的应用

两种或多种蛋白质之间的相互作⽤促进多种生物功能的发挥，构成生理过程的基础。探究蛋⽩质的相互作⽤对于了解健康和疾病的生理过程至关重要。因此，蛋白质科学和相互作用方法可被视为生物和医学研究中最广泛的应用之一，并构成了药理学理论的基础之一。酶标仪的运用使全面记录蛋白质结合事件成为可能。

寻找研究蛋白质互作的最佳方法

近年来，酶标仪的使用彻底改变了蛋白质相互作用研究领域，这主要归功于检测方法众多。找到合适方法对于确保高数据质量和精确结果至关重要。虽然在利用酶标仪研究蛋白质相互作用的应用中，一些基于吸光度的方法（如夹心ELISA）仍在使用，但基于荧光或化学发光的方法如今更为常见，这是因为荧光或化学发光法具有灵敏度高、高通量兼容性强等优点。在这方面，通常采用基于福斯特共振能量转移（FRET）和生物发光共振能量转移（BRET）的检测方法。BRET和FRET都是基于两个信号分子之间的能量转移。通过将两个信号分子连接到两个相关蛋白质上，利用这种信号转移来检测二者之间的相互作用。两种蛋白质之间的结合使附着的信号分子在空间上相互靠近，从而实现能量转移（图1）。

图1：使用CFP和YFP进行 FRET检测的示例。A) CFP 和 YFP 的光谱：CFP（供体）发射光谱与YFP（受体）激发光谱发生重叠（光谱重叠）。B) FRET示意图：在两种蛋白质没有相互作用的情况下，CFP被激发并发出特定波长的光。C) 当两者发生相互作用，FRET发生，YFP发出另一种波长的光，而CFP的发光强度会被淬灭。

基于BRET和FRET原理开发的先进应用可进一步提高蛋白质相互作用测量的灵敏度和读出质量。比如在基于NanoBRET技术的应用中，使用从深海虾中提取的 NanoLuc® 荧光素酶作为信号分子，与传统的荧光素酶相比，信号输出量大大增加。

下面的例子基于NanoBRET方法，能够检测蛋白质的泛素化过程。泛素标记需要被细胞内的酶降解的蛋白质，这一过程由蛋白质靶向嵌合体（PROTACs）促进。PROTACs的这一特性为靶向降解与疾病有关的蛋白质提供了特殊的治疗潜力。我们通过动力学实验研究蛋白质BRD4的泛素化。为此，利用CRISPR/Cas-9基因组编辑技术用HiBiT（NanoLuc荧光素酶的一个亚基）标记BRD4。并且用NanoBRET受体 HaloTag® 标记单个泛素分子。通过PROTAC ARV-771对BRD4进行泛素化，使 NanoLuc荧光素酶靠近被标记的泛素分子，从而使 BRET 信号以浓度依赖的方式随着泛素化的进行而增加（图2）。

图2：监测蛋白质BRD4泛素化的NanoBRET试验。在泛素化过程中，随着泛素与BRD4在空间上的接近，与BRD4相耦合的NanoLuc荧光素酶和与泛素分子相耦合的HaloTag之间基于BRET的能量转移增加。

这一应用实例证明，在检测极低浓度的PROTAC时，基于NanoBRET的方法灵敏度较高。

TR-FRET是将时间分辨测量与FRET原理相结合，使用的信号分子随着时间的推移具有很高的信号稳定性。这样就可以利用时间窗口来测量蛋白质之间的相互作用，在相互作用信号仍可被检测到的同时，来自检测背景的信号已大部分消退，从而大大提高了灵敏度。基于TR-FRET的检测通常用于研究受体与其配体的相互作用。

酶标仪在蛋白质互作研究中发挥的作用

由于上述蛋白质相互作用测定通常是在高通量条件下进行的，因此将台式测定转换为自动化高通量筛选（HTS）测定会受到一些特定的限制。其中的重要因素是酶标仪的灵敏度和速度，以及自动化兼容性。通过分析相互作用测量的结合曲线，可以深入了解蛋白质互作的结合动力学、解离常数和化学计量学。包括所有BMG LABTECH设备在内的先进酶标仪还可提供动力学测量，支持结合曲线的测量。

图3：BMG LABTECH的PHERAstar® FSX是一款HTS专用多功能酶标仪。配备专用功能，是研究蛋白质相互作用的利器。

HTS专用多功能酶标仪（如BMG LABTECH的PHERAstar® FSX）是解决这些问题的理想检测平台。由于可提供所有常用的检测模式，并能满足筛选所需的性能，为检测选择提供了充分的灵活性。除此之外，PHERAstar® FSX酶标仪还可配备专用功能，用于更详细、更灵敏地分析蛋白质相互作用。板载试剂移液器、同时检测两个发射信号（SDE）和超高速采样等功能可实现高通量实时动力学相互作用分析。与各种机械臂平台和软件接口的兼容性还可使检测实现完全自动化。

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