液相色谱微型化：我们为什么这样做？

Evert-Jan Sneekes, Laurent Rieux 和Remco Swart

赛默飞世尔科技，荷兰阿姆斯特丹

 

液相色谱 (LC) 微型化通常是为了提高灵敏度，这是蛋白质组学检测低丰度肽和蛋白质的必然要求。微型化的其他优点还包括提高与质谱连接的效率并降低溶剂的消耗。如今，微型化液相色谱更容易使用，它的仪器操作和连接方式均与常规液相色谱系统一样。这为微型化液相色谱特别是毛细管和微流液相色谱应用于新的工作流程和应用领域提供了更多机会。

 

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微型化液相色谱技术的发展始于约三十年前，1987 年出现了首批商品化产品。随着时间的推移，纳升液相色谱成为生物分析研究不可或缺的工具，尤其是在要求最高级别灵敏度的蛋白质组学领域。然而，随着纳升液相色谱在蛋白质组学实验室中的日常应用，人们有时会遗忘灵敏度提高的原理。了解这些原理及其实际影响有助于帮助人们看到微型化液相色谱将如何为蛋白质组学、生物分析等带来益处。

 

为了解内径较小的色谱柱会使灵敏度增加这一点，首先必须明确样品浓度和样品量之间的差异。这可以归纳如下：

• 液相色谱的样品进样是指一定体积的某浓度样品的注入

- 这是一个固定量：例如 1 μL 1 pmol/μL = 1 pmol

• 进样时，这个样品固定量被液相色谱系统稀释

- 这将得到一个新的浓度

• 在相同进样量情况下，较小体积的液相色谱将产生较高浓度

- 与大内径色谱柱相比，内径较小的色谱柱灵敏度更高

 

 

图1 显示了在内径分别为4.6 mm 和 75 μm 的色谱柱上注入相同进样量（四条“肽”），显然后者的浓度更高些。相对增加的灵敏度可以采用公式1 计算。

 

 

光学检测器（如紫外检测器）和电喷雾质谱仪属于浓度敏感型仪器。它们的信号与从色谱柱洗脱峰中样品的浓度成正比。

 

图2 绘制了不同直径的色谱柱较直径为4.6 毫米的色谱柱的灵敏度相对增加（按公式1 计算）。从图中可看出，内径最小（50 μm 和 75 μm）的色谱柱，其灵敏度在理论上可提高几千倍。然而，插图显示色谱柱内径从4.6 mm 变为1 mm 时，灵敏度已能得到显著提高（约20 倍）。在一些不要求绝对灵敏度，但微型化可以提供其它益处，例如与质谱轻松连接，减少溶剂用量（见计算示例）和废液处置量并降低成本的情况下，这些色谱柱内径范围完全适合实际应用。

 

减少溶剂用量：

设想以如下参数在内径为 4.6mm 的色谱柱上进行分析：

- 流速为1.0 mL / min

- 70％ 流动相A

- 2 公升溶剂瓶

所有流动相A 将在两天内耗尽。

采用微流速液相色谱法以50 μL/min 的流速运行本应用，500 mL 的瓶子可维持一周。

 

 

图2. 一系列内径的色谱柱相较于内径为4.6 mm 的色谱柱灵敏度的相对提高倍数

 

计算得出的灵敏度增量实际上是常规和微型化液相色谱应用之间的比例因子，而流速是最好的例子。通常情况下，常规液相色谱中的流速（内径为4.6 mm）为1000-1200μL/min，纳升级液相色谱（内径为75μm）为0.250-0.300μL/min。4000 的比率反映内径为4.6 mm 的色谱柱与纳升级液相色谱柱之间的比例因子，并将导致两个色谱柱的线性速度（大致）相同。

 

Thermo Scientific^TM Dionex^TM UltiMate^TM 3000 RSLCnano 系统（图3）旨在为现代纳升液相色谱提供所需的非常低的流速和非常高的压力。UltiMate 3000 RSLCnano 系统在UHPLC 压力条件下，提供的流速可低至20 nL/min*、高至50μL/min，使其成为可实现纳升级、毛细管级和微流速液相色谱分析的完美仪器。1 模块具有内置柱温箱，可支持一系列应用，同时可最大限度地缩短各种元件之间的物理距离。这可使连接管尽可能地缩短。

 

连接管的另一个重要方面是管路内径。纳升级液相色谱 (20 μm) 的连接管内径大约比常规管路内径小10 倍。通常，毛细管级和微流速液相色谱分别采用内径为50μm 和 75 μm 的连接管。

 

如果正确连接合适的管路，就会得到最好的结果。Thermo Scientific^TM Dionex^TM nanoViper^TM 接头系统可提供厂制、手紧UHPLC 接头，零死体积。nanoViper 接头和连接管及色谱柱集于一体，无需工具即可组装，且没有引入死体积或连接时毛细管断裂的风险。

* 要求时才会提供最低流速

 

 

图3. UltiMate 3000 RSLCnano 系统、内视图和nanoViper 接头

 

 

微型化液相色谱通常可分为三类或三种流速范围：纳升级、毛细管级和微流速液相色谱。纳升级液相色谱是指流速低于1000 nL/min的应用，毛细管级液相色谱包含低流速范围 (1–10 μL/min) 的应用，而微流速液相色谱涵盖流速超过10 μL/min 的应用。

 

以下是各流速范围的典型应用示例。第一个也是最常见的示例，纳升级液相色谱应用于蛋白质组学发现工作流程中。在这里，样品量的限制是使用纳升级液相色谱的主要原因。在第二个例子中，毛细管级液相色谱被应用于复杂基质中目标肽的定量分析。样品可能较易得到，但通量也很关键，毛细管级液相色谱可做到二者兼顾。对于第三个示例，微流速液相色谱被用来提高单克隆抗体 (MAb) 消化物分析中的通量。在这里，样品量不再是限制因素，但增加的灵敏度和系统耐用性很有价值。最后，给出一个非生物分析的例子。

 

在蛋白质组学研究中，研究人员面临着双重挑战。待研究的蛋白质浓度低且样品体积小，导致含量极低。此外，样品非常复杂。这些因素促使开发出纳升级液相色谱系统和具有非常高分离能力的色谱柱，确保特殊应用，如图4 所示。科赫尔 (Köcher) 等人进行了类似的实验，他们通过在 50 cm 的色谱柱上进行8 小时梯度洗脱，从而在胰蛋白酶消化的HeLa 细胞中平均鉴别出2516个蛋白质。²

 

图4. 在75 μm（内径）×50 cm 的纳升级液相色谱柱上经10 小时梯度洗脱后高分辨率分离的大肠杆菌消化物

 

下一个例子是毛细管级液相色谱在目标定量工作流程中的应用。在本例中，选择毛细管级液相色谱来增加通量、提高耐用性和易用性，同时保持很高的灵敏度。在内径为300 μm 的色谱柱上分离出添加同位素标记肽的酵母消化物。样品在30 分钟内以流速4μL/min 被分离，并连接到采用标准HESI-II 接口的Thermo Scientific^TM TSQ Vantage^TM 三重四极杆质谱仪，在SRM 模式下进行检测，检测限达到10 amol（图5）。更多详情可参阅Thermo Scientific 的应用报告583。³

 

图5. 按不同浓度向500 ng 酵母消化物基质中加入肽SAAGAFGPELSR 的提取色谱图

 

以下微流速示例对生物制药行业中高效率和高通量肽谱图匹配应用特别适用。在这个特定例子中，首先以6 μL/min 流速通过30 分钟梯度洗脱分离单克隆抗体消化物。在两个连续步骤中，流速升高至15μL/min，同时梯度缩短。图6 显示了在不降低数据质量的情况下分析时间如何缩短到1/3。以类似的方式提高标准粒径填料液相色谱柱上的流速，可能会使色谱系统与质谱仪的连接变得复杂，并需要每日更换两次流动相。

 

图6. 在300 μm（内径）×15 cm 的 Thermo Scientific^TM Acclaim^TM PepMap^TM RSLC 分析柱上加速分析单克隆抗体Lys C 消化物

 

最后，Xiang He 等人展示了微流速液相色谱在法医毒理学等领域取得的可喜成果。4 建立了简便、高灵敏的方法，可量化分析生物样品中的大麻素，满足法医毒理学的需要。这种方法在设计和循环时间上与典型的标准粒径填料应用类似，但灵敏度更高，可以分析进一步稀释的样品。法医毒理学者可将这种多用途的工作流程应用于其他常见的非法/ 滥用药物定量分析。试剂的消耗量也会显著降低90％以上，并降低质谱仪的维护频率。

 

液相色谱仪的微型化通常仅被认为与蛋白质组学研究所要求的可提供更高灵敏度的纳升级液相色谱相关。但是，毛细管级和微流速液相色谱已大幅度提高了灵敏度。此外，在整个流速范围内（从纳升级到传统规格），可以保证UHPLC 的能力，大大简化了分析的规模，而且不会影响到性能。

 

虽然蛋白质组学仍是纳升级液相色谱应用的主要焦点，但在生物制药和法医/ 毒理学应用方面亦有很多潜力。如前所述，用户使用微型化液相色谱不但能提高灵敏度，而且更轻松地与质谱连接，同时还大幅降低了样品和溶剂的消耗量。这不但补偿了延长的操作时间，还降低了操作成本。切换到毛细管级液相色谱或微流速液相色谱意味着灵敏度和耐用性、通量和易用性之间达到完美平衡。

 

所以重新回到标题中的问题：“液相色谱仪的微型化; 为什么我们这样做呢？”，因为有很多裨益！

 

1. Rieux, L.; Sneekes, E-J.; Swart, R. Nano LC: Principles, Evolution, and State-of-the-Art of the Technique. LCGC NA2011, 29 (10), 926–934, [Online] http://www.chromatographyonline. com/lcgc/ Column%3A+Innovations+in+HPLC/Nano-LC-Principles-Evolution-and-State-of-the- Art

/ArticleStandard/Article/detail/745381 (accessed August 7,2013).

2. Köcher, T.; Swart, R.; Mechtler, K. Anal. Chem. 2011, 83, 2699–2704.

3. Kiyonami, R.; Swart, R; Zabrouskov, V.; Huhmer, A. Increased Robustness and Throughput for Targeted Protein Quantification Using Capillary Flow and a Conventional ESI Probe, Thermo Scientific Application Note 583, [Online] http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/techres ource

resourceId=102334&storeId=11152&from=search# (accessed August 7, 2013).

4. He, X.; Kozak, M.; Nimkar, S. Anal. Chem. 2012, 84 (18), 7643–7647.