药物研发早期阶段EarlyToxTM心肌毒性检测试剂盒的生物相关心肌毒性评价实验

 

 

在药物研发早期进行心急毒性评价是非常重要的，以便于排除潜在的有毒副作用的化合物，从而开展进一步的研究。高度预测性的生物相关性体外高通量筛选分析实验对于提高效率和降低心脏安全性评价失败的化合物筛选的高成本来说是至关重要的。干细胞分化的心肌细胞是特别完美的细胞模型，因为它们表达了GPCRs 和离子通道，表现出自发的类似原始心肌细胞的机械的和电学活性。

 

EarlyTox^TM心急毒性试剂盒包含一个新型的钙离子敏感染料和一个专有的进过优化的屏蔽技术，用来检测与心肌细胞跳动关联的的胞质内钙离子浓度的变化。跳动模式的信号特征表现时间很短。由于相机曝光时间短,细胞内的钙离子结合染料产生的信号比标准的钙流分析实验小。这种新配方的试剂盒比其它商用钙染料能提供更强的信号。如图1 中所示，起到屏蔽作用的分子不会进入细胞内，但降低了细胞外背景荧光信号。这些特性有助于提高信号窗口，为心肌跳动波形图检测提供更多详细信息。

 

 

 

 

这个检测分析试剂盒可用于分析药物对峰值频率（BPM）、峰值幅度和跳动波形图的影响，且被设计为用于干细胞分化的心肌细胞或原代心肌细胞。峰值频率取决于EarlyTox 心肌毒性染料监测的细胞内钙离子浓度的变化。在单个的心跳周期内，肌质网被激活后Ca²⁺被释放进入胞质内。钙结合肌钙蛋白激活肌小节，引起细胞收缩。同步地，细胞中染料分子与游离的钙离子结合增加了荧光信号强度。

 

心肌细胞舒张发生于钙离子泵把细胞内的钙离子摄取回肌质网并和细胞外液进行钙离子交换时。荧光信号强度随着钙离子浓度降低而减小。随着下一个心跳周期重复开始，荧光信号峰值随着心跳同步被记录。

 

使用EarlyTox^TM心急毒性试剂盒在FLIPR^Tetra 系统中已经对心肌细胞的钙离子峰值频率和非典型波形图的浓度依赖性调控方式进行了验证， 并通过ScreenWorks®Peak Pro 软件作进一步的分析。确证参数的改变，如钙离子峰值频率、振幅、峰宽、增长和衰减的时间有助于对构效关系（SAR）方向修正或者排除化合物进入药物化学或临床前研发的评判。另外，这种方法还可以用于作用于心脏的新化合物开发。

 

在生物相关性心急毒性分析实验中进行功能性研究

最大限度减少染料对心肌细胞跳动特性的非特异性影响

在最大的可用信号中观察时间分辨率

无需几小时，在数分钟内检测384 个样品

 

本实验中所使用的心肌细胞，来源于Cellular Dynamics International 的人诱导多能干细胞（iPS）分化的心肌细胞，根据建议的方案进行培养。实验前细胞被培养在黑壁底透的384 孔板中10~14 天。EarlyTox Cardiotoxicity Explorer Kit (R8210) 染料加载缓冲液加热至37°C 以避免降低心肌细胞的跳动。加入25μL 染料至多孔板中每孔25μL 的细胞体系中。细胞板放置于5% CO2，37℃条件下孵育2 小时。

 

试剂盒中含有三个参考化合物——普萘洛尔、异丙肾上腺素和索他洛尔，用于验证iPS C 心肌细胞不同刺激下的反应状态。准备好的化合物板中药物的每个检测浓度是终浓度的5 倍并在加样前加热至37℃，以减少温度对细胞的影响。当在FLIPR^Tetra中系统添加化合物后，可以对细胞跳动频率和波形图观察记录持续4~6 小时。化合物添加后继续记录10 分钟。可以额外记录读取几个时间点直至4 个小时的信号。

 

对照和EarlyTox 心肌试剂盒中的三个参考化合物的峰值频率和跳动波形图实验结果见图2~5。

 

 

 

多种钙离子指示染料以及其各自在细胞跳动、平均峰值振幅以及峰值频率等方面的作用进行了4小时长时间的实验比较。这些染料包括EarlyTox心急毒性染料, FLIPR. Calcium 5 试剂盒 (Molecular Devices)和Fluo-4 Direct 试剂盒(Invitrogen)。根据供应商产品说明，染料加入iPSC 心肌细胞中共孵育。使用FLIPRTetra系统对加样前和加样后几个时间点的结果进行记录。此实验中同时设置了对照孔。如图6 和7 中所示， 所有EarlyTox 心急毒性染料的峰值频率和信号振幅均是最高的。图8 中可以看到，EarlyTox 心急毒性染料对化合物添加后4 小时内细胞跳动能力（消失）没有影响。FLIPR Calcium 5 染料作用下的多数细胞停止跳动，而Fluo-4 Direct 染料在加入化合物90 分钟后所有孔均停止跳动。

 

 

 

 

 

 

EarlyTox 心肌毒性染料已进行优化，可以提供更强信号、高通量方法来检测药用化合物对干细胞分化的心肌细胞的效应。优化了的染料成分可以产生更大的信号窗口和显著的降低试剂自身对心肌跳动、峰值频率或信号振幅等随着时间变化的很小的非特异性毒性作用，有别与其它类型的试剂染料。EarlyTox 心肌毒性染料配套FLIPRTetra 系统使用，是药物研发早期检测化合物心肌毒性和确证潜在心脏候选药物发现的强大工具。