实现蛋白marker与Annexin V双染的同时检测的实验方法

要用AnnexinV双染法测凋亡，又想同时标记蛋白marker，甚至还有胞内指标，可是PI和7-AAD都不能洗，怎么办？

eBioscience的可固定细胞活力染料Fixable Viability Dye帮您完美解决

固定、破膜以及洗涤步骤不影响Fixable Viability Dye的染色，而PI、7-AAD的染色通常是放在其他抗体孵育完成后进行，不能洗涤即要上机检测；对于胞内抗体的染色，由于经过了固定步骤，经过PI或7-AAD染色后所有的细胞都是阳性，所以他们只适合于胞膜染色的死活细胞鉴定 
   
实验试剂
◎ Annexin V Apoptosis Detection kit (Cat. No. 88-8007, 88-8006, 88-8005, 88-8102, or 88-8008)
◎ 10X Binding buffer
◎ Annexin conjugated to APC, eFluor 450, FITC, PE or PerCP-eFluor 710
◎ Fixable Viability Dye eFluor® 660 (Cat. No. 65-0864), Fixable Viability Dye eFluor® 506 (Cat. No. 65-0866) or Fixable Viability Dye eFluor® 780 (Cat. No. 65-0865)
注意: Fixable Viability Dye eFluor® 450不推荐与AnnexinV检测试剂盒同时使用
◎ Foxp3 Staining Buffer Set (Cat. No. 00-5523)
◎ Flow Cytometry Staining Buffer (Cat. No. 00-4222)
◎ PBS (azide- and serum/protein-free PBS) 
   
试验方法   
1. 用蒸馏水稀释 10X Binding Buffer 至 1X ；
2. 标记表面marker；
3. 用不含叠氮钠及血清的PBS洗细胞两次；
4. 在不含叠氮钠及血清的PBS按1-10x106 cells/mL 的浓度重悬细胞；
5. 每1mL细胞中加入 1 μL of Fixable Viability Dye并立即涡旋混匀；
6. 2-8°C避光孵育30分钟；
7. 孵育完成后，务必用含蛋白的缓冲液，如Flow Cytometry Staining Buffer洗两次细胞；
8. 用1X Binding Buffer洗一次细胞；
9. 在1X Binding Buffer中按1-5x106 cells/mL浓度重悬细胞；
10. 100 μL细胞悬液中加入5 μL荧光标记的Annexin V；
11. 室温避光孵育10-15分钟；
12. 用1X Binding Buffer洗细胞一次；
13. 固定破膜，用破膜缓冲液洗细胞；
注意: 此时已经不需要保持缓冲液中的钙离子，因为AnnexinV已经结合到细胞表面了
14. 进行胞内marker的标记；
15. 完成后上机分析。

更多关于Fixable Viability Dye的介绍，请看链接：
http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2013110007.html    

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