使用UPC2/MS/MS对蛋白沉淀血浆中的极性化合物直接进样

Jennifer L. Simeone and Paul D. Rainville

目的
对蛋白沉淀血浆中的强极性化合物直接进样分离，以进行生物分析。

背景
大多数生物分析方法都采用蛋白质沉淀(PPT)提取法，这是因为该技术简单、快速且成本较低。典型的PPT使用3:1的有机溶剂与生物样品，可得到大约75%的有机提取物。传统上，通常会采用反相液相色谱(RPLC)分析样品。对于强极性化合物而言，由于强溶剂作用产生的色谱峰形较差，最为明显的是出现峰前伸和/或谱峰分叉，因此不能直接将高浓度有机提取物注入RPLC系统。因此，在向色谱系统进样之前需要进行额外的样品处理，包括蒸发和复溶或用水稀释。

通过从RPLC到UPC²改变MS入口技术，无需蒸发和复溶等额外样品制备步骤，便可以直接进样分离高度有机样品中的极性化合物。

图1. 在反相模式下运行的UPLC®中，咖啡因PPT提取物通过(a)1 µL进样、(b)3µL进样获得的示例色谱图，以及在ACQUITY UPC²系统中，相同咖啡因PPT提取物的(c)7µL进样示例色谱图。

解决方案
UltraPerformance Convergence Chromatography™(UPC²®)使用超临界二氧化碳作为主要流动相，其保留机制与RPLC不同，可直接进样高度有机提取物。在本示例中，通过PPT提取法使用乙腈以3:1的比率从大鼠血浆中提取了四种极性较强的化合物，直接进样至ACQUITY UPC²™系统中，并使用传统RPLC系统作为对比。UPC²分析在ACQUITY UPC² BEH色谱柱上进行，采用经氢氧化铵改性的甲醇作为共溶剂(流动相B)。RPLC分析在配备ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱的ACQUITY UPLC®系统上进行，采用水和经氢氧化铵改性的乙腈作为流动相。

图1将含咖啡因的PPT提取物在ACQUITY UPLC系统中的1µL直接进样和3 µL直接进样与在ACQUITYUPC²系统中的7µL进样进行了对比。RPLC中的1µL进样显示出良好的峰形，但在3µL进样体积下峰形发生变形，可以观察到前伸峰和谱峰分叉。而采用UPC²进行的7µL进样依然表现出良好的峰形。以相同方式测试的其它极性分子也观察到类似的结果(表1)。表1还显示了使用RPLC和UPC²时，在PPT提取物中测试的所有分析物的最大进样体积。

这些数据明确证实了使用ACQUITY UPC²系统分析高度有机提取物中极性化合物的优势，并且不必像RPLC系统那样在进样前需要进行额外的样品制备，从而简化了工作流程。

总结
通过从标准RPLC到UPC²改变MS入口技术，无需蒸发和复溶等额外样品制备步骤，便可以直接在ACQUITY UPC²系统中注入溶于高度有机样品中的极性化合物。为生物分析实验室增添UPC²可以简化高度有机样品制剂中极性化合物的分析。