半制备规模单链RNA纯化

Sean M. McCarthy and Martin Gilar

Waters Corporation, Milford, MA, U.S.

寡核苷酸合成是非常高效和高产率的过程。在固相载体上进行寡核苷酸反应的典型产率为每耦合阶98～99.5%。在典型的多阶寡核苷酸合成中，杂质聚集在一起，即使是一般大小的21基体寡核苷酸的总产率也达到67～90%，较长链的寡核苷酸的产率相应较低。研究人员通常需要使用纯度高于初步合成混合物的材料。因此，用于基因敲除、基因分型和诊断目的寡核苷酸通常需要在合成后进行纯化。适合实验室规模寡核苷酸纯化的经济可行的解决方案很少，而现有的方法（比如离子交换色谱分析法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法）通常比较繁琐和费时。在本应用说明书中，我们介绍了一种成本低、速度快的中等数量材料的纯化方法，单次进样载量高达140 nmoles，采用沃特世 ACQUITY UPLC^®系统和寡核苷酸分离技术（OST）色谱柱化学技术可达到95%以上的最终纯度。所提出的纯化规模与标准的寡核苷酸合成规模匹配良好（50至250 nmol）。下述方法可在15至30分钟时间内完成寡核苷酸纯化，得到高纯度产品。

 

RNA寡核苷酸5' -CCU UGU AAU CGC UUG ACG ATT -3'由供应商处购买，并在110 μL的0.1 M 醋酸三乙胺（TEAA)中进行复溶，得到大约2.8nmol/ μL的溶液。为防止降解，样品是在使用前不久制备的。

 

RNA寡核苷酸通过沃特世Alliance^® HPLC生物分离系统进行纯化，使用了沃特世 XBridge™ BEH OST C18 4.6 x 50mm的2.5 μm色谱柱，采用离子对反相色谱法进行分离。¹

 

液相色谱系统：沃特世 Alliance HPLC生物分离系统

色谱柱： XBridge OST BEH C18 4.6 x 50mm, 2.5 μm

柱温： 60 ˚C

流速： 1.0mL/min

流动相A： 0.1M TEAA，pH 7.5

流动相B： 80:20 0.1MTEAA/ACN

梯度： 30 – 52.5% B洗脱10.0分钟(0.15% ACN／分钟）

检测： PDA，260nm

 

分离产物用沃特世 PDA检测器在260nm处检测。流动相A由0.1% M醋酸三乙胺（TEAA）组成，流动相B为80:200.1 MTEAA/乙腈。柱温保持在 60℃。

 

如图1中所示，尽管寡核苷酸合成的效率很高，在21-基体中仍存在许多失败序列。

 

尽管色谱柱上超负荷加载了更大的质量负荷，分离度仍保持N-1, N-2... 杂质在主峰前洗脱。对21-基体寡核苷酸主峰从顶点开始进行适当的切割，就会得到极高纯度的产物。

 

图2中所示被选中的馏份收集窗表示不同的质量负荷。峰值采集后，样品可以根据需要对等分和干燥，以便长期储存。TEAA的挥发性使离子对缓冲组分的去除非常容易。溶剂蒸发后被纯化的寡核苷酸实际上是不含盐的。

 

纯化RNA寡核苷酸的纯度通过ACQUITY UPLC系统来验证。如图3所示，我们的纯化方法有效地减少了失败序列杂质，所产生的寡核苷酸的纯度比市面上可以买到的未经纯化的寡核苷酸高出许多。

 

液相色谱系统： 沃特世 ACQUITY UPLC系统

色谱柱： ACQUITY UPLC OST C18柱，

2.1 x 50mm，1.7 μm

柱温： 60 ˚C

流速： 0.2 mL/min

流动相A： 0.1M TEAA，pH 7.5

流动相B： 80:20 0.1MTEAA/ACN

梯度： 35 – 85% B洗脱10.0分钟

(1%ACN／分钟）

检测： PDA，260 nm

 

本文介绍的单链RNA寡核苷酸的纯化策略速度快，成本低，可生成高纯度材料。使用OST色谱柱化学技术和Alliance HPLC系统，大量的单链RNA粗产物可以在短时间内成功纯化，进而得到高纯度（约95%）的材料；根据所收集峰面积与样品总峰面积的比值进行估计，产率可达55%。

 

该方法对用于RNAi实验（这类实验中保证纯度和目标的特异性至关重要）的单链RNA的纯化极为有用。此外，由于T EAA的可挥发性，该策略可以将纯化的寡核苷酸储存，在没有T EAA这种不必要的盐的环境中，也可以避免其他纯化手段中产生的不必要的杂质。总的来说，该策略提出了一个比目前可用方法更优越的全面纯化方法。此外，在考虑样品纯化所需的时间成本、反应剂和沃特世XBridge OST色谱的寿命时，这种纯化方法非常经济。

 

[1] 寡核苷酸的UPLC分离：方法开发。沃特世应用说明书。2007: 720002383EN。

 

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