国产蛋白纯化仪做离子交换层析实验指南
离子交换层析实验指南
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEX）是一种基于蛋白等电点（pI）和缓冲液 pH 之间的电荷差异，利用离子交换介质对带正电（阳离子交换）或负电（阴离子交换）的蛋白进行分离的方法。该方法可用于蛋白纯化、去除杂质、浓缩目标蛋白等。
1. 实验原理
离子交换层析依赖于蛋白的净电荷与固定相的相互作用：
阳离子交换层析（Cation Exchange, CEX）：固定相带负电，结合带正电的蛋白（pH < pI）。
常用填料：CM-Cellulose, SP-Sepharose。
常用填料：CM-Cellulose, SP-Sepharose。
阴离子交换层析（Anion Exchange, AEX）：固定相带正电，结合带负电的蛋白（pH > pI）。
常用填料：DEAE-Cellulose, Q-Sepharose。
在不同盐浓度（如 NaCl 梯度）或 pH 梯度的作用下，结合的蛋白被依次洗脱，实现分离。
2. 实验材料与设备
(1) 试剂与填料
- 离子交换填料（如 Q Sepharose Fast Flow, SP Sepharose Fast Flow）。
- 缓冲液（一般选择 pKa 接近目标蛋白 pI 的缓冲体系）。常用缓冲液：
- Tris-HCl（pH 7.0-8.5）
- HEPES（pH 6.8-8.2）
- MES（pH 5.5-6.7）
- 洗脱盐溶液：通常为 0-1 M NaCl 梯度洗脱，或 KCl、(NH₄)₂SO₄。
(2) 设备
层析柱（如 HiTrap Q FF 5 mL, HiTrap SP FF 5 mL）。
层析系统（Hass25 AKTA、FPLC等）。
（图例使用辉因科技全具备自主知识产权国产蛋白纯化系统Hy-Hass25）
（图例使用辉因科技全具备自主知识产权国产蛋白纯化系统Hy-Hass25）
辉因科技蛋白纯化系统Hy-Hass25
紫外检测仪（280 nm 监测蛋白洗脱）。
3. 实验步骤
Step 1. 预处理
样品准备：
细胞裂解、离心（10,000 x g, 10 min），取上清。
0.22 μm 过滤，去除颗粒和杂质。
调节缓冲液 pH 以确保目标蛋白带相应电荷（pH < pI 选 CEX，pH > pI 选 AEX）。
调节离子强度，低盐（<50 mM NaCl）可增强蛋白吸附。
柱子平衡：
用 5 倍柱体积（CV）的平衡缓冲液清洗柱子，流速 1-2 mL/min。
监测 280 nm 吸光度，确保基线稳定。
Step 2. 蛋白结合
样品加载：
以 1 mL/min 低流速 加载蛋白（最大不超过柱体积的 10%）。
监测 280 nm，确保蛋白吸附完全（流出液 A280 降低）。
洗涤杂质：
继续用平衡缓冲液清洗柱子，直到流出液 A280 降至基线（去除未结合蛋白）。
Step 3. 洗脱蛋白
梯度洗脱：
使用 0-1 M NaCl 线性梯度（通常 10-20 CV）。
逐步增加盐浓度，使不同结合力的蛋白依次洗脱。
监测 280 nm，记录蛋白洗脱峰。
等度洗脱（可选）：
直接用 0.5-1 M NaCl 缓冲液一步洗脱目标蛋白（适用于已知洗脱条件的蛋白）。
Step 4. 分段收集与后处理
收集洗脱组分：
根据 UV 吸收峰，分段收集蛋白组分。
用 SDS-PAGE 确定目标蛋白所在的洗脱组分。
缓冲液置换：
透析或超滤换至目标缓冲液（如 PBS、Tris-HCl）。
浓缩蛋白（如使用 10 kDa 超滤离心管）。
4. 优化策略
(1) 提高分辨率
降低流速（0.5-1 mL/min），减少峰扩散。
优化梯度洗脱（线性梯度 vs. 分步梯度）。
(2) 提高结合效率
选择合适的 pH，使蛋白带足够电荷。
低离子强度（<50 mM NaCl）有助于蛋白结合。
(3) 目标蛋白洗脱优化
低 pH 或高 pH 改变蛋白电荷状态，帮助洗脱。
除了 NaCl，也可尝试 KCl 或 (NH₄)₂SO₄。
5. 结果分析
SDS-PAGE：检测目标蛋白的纯度。
UV 280 nm 吸收峰：确认目标蛋白的洗脱位置。
蛋白浓度测定（Bradford/BCA 法）：计算蛋白回收率。
6. 常见问题及解决方案
问题 可能原因 解决方案
目标蛋白未结合柱子 pH 不合适，蛋白未带电 调整 pH 使蛋白带电
目标蛋白流失在洗脱前 样品盐浓度过高 降低 NaCl 浓度 <50 mM
目标蛋白洗脱不完全 盐浓度不够 提高 NaCl 梯度（0-1 M）
目标蛋白变性 pH 过低或过高 选择温和 pH（pH 6-8）
7. 典型实验参数
参数 设定值
柱体积 5 mL (HiTrap Q/SP)
流速 1 mL/min
平衡缓冲液 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl
洗脱方式 0-1 M NaCl 梯度洗脱 (20 CV)
收集方式 1 mL 分段收集
仪器 尽量选择优质稳定的仪器，这样可以去除设备因素
总结
离子交换层析是一种高效的蛋白纯化方法，通过调节 pH 和盐梯度，可获得高纯度目标蛋白。合理选择 缓冲体系、填料和梯度洗脱方式，可显著提高分辨率和回收率。
如果你有特定蛋白或设备的需求，可进一步优化实验条件！
