UP.SIGHT 2.0 双重验证技术赋能单克隆细胞株开发，单克隆性超99.99%
单克隆细胞株的开发在生物制药生产（如单克隆抗体制备）中占据关键地位。为了确保产品的一致性，所使用的细胞株必须来源于单个细胞。常见的克隆工作流程通常包括一至两轮的单细胞克隆，随后通过孔板成像确认单细胞是否成功分配。然而，传统的有限稀释法或流式细胞术等方法并不能有效验证是否仅分配了单个细胞，这使得单克隆性的确认过于依赖孔板成像的准确性。孔板成像在细胞检测时存在固有误差，同时需要依赖离心操作以确保所有细胞位于成像焦平面内。这些误差的累积降低了在特定工作流程中实现单克隆性的可能性，因此，高精度的成像技术和检测方法显得尤为重要。
UP.SIGHT 2.0 （影像式单细胞打印与成像系统）通过双重验证机制有效解决了细胞分配中的挑战。该系统的第一次验证是通过一系列喷嘴图像记录单细胞的分离情况，第二次验证则采用3D全孔成像技术直接捕获液体体积的图像。这种3D成像技术能够完整捕捉液体体积，从而避免了克隆后所需的离心操作。此外，UP.SIGHT 2.0还支持菌落生长后的实时监测，兼容96、384和1536孔板，适用于高通量工作流程，且单细胞分配效率超过98%。
图1. UP.SIGHT 2.0
本研究分析了4000个单细胞和近1000个生长的菌落，结果表明：结合喷嘴图像与3D全孔成像，细胞株的单克隆性概率超过99.99%，且无需依赖荧光染色或成像技术。
结果展示
1. 在一个设备中提供单细胞分配、孔内验证和菌落跟踪功能
UP.SIGHT 2.0为克隆、克隆验证和追踪提供了一个完整的工作流程（图2）。流程的第一步是将细胞悬浮液加载到设备中的一次性墨盒中。在单细胞分配过程中，喷嘴会生成微型自由飞行液滴，并持续进行成像（图2.1）。图像处理算法实时评估即将到来的液滴，判断其是否包含0、1或多个细胞。如果液滴被判定为包含0、多个细胞，或尽管只含一个细胞但其特征（如大小、圆度或荧光强度）不符合预设标准，该液滴将被丢弃。相反，若检测到1个单细胞，且该细胞的大小、圆度和荧光强度等均符合标准，则该细胞将被分配至孔板中。针对每个成功分配的单细胞，系统会生成五张图像，以确认单细胞的分离与排出情况。分配完成后，使用孔板下方的第二台相机进行 3D 全孔成像，捕获孔中的一系列图像（图2.2），这一成像设备为目标孔中分配的单细胞提供了二次确认。
3D全孔成像捕获的图像数量取决于板的类型和孔中介质的体积，这种成像方式消除了对孔板进行离心的需求。由于成像是细胞在介质中沉降时进行的，而细胞通常位于液体体积的上半部分，因此与仅在孔底进行第0天成像相比，这种方式大大减少了由于板或边缘效应造成的畸变影响，从而提升了细胞检测的准确性。
在克隆后的阶段，UP.SIGHT 2.0能够对具有理想生长曲线的特定克隆进行成像并追踪其群体生长（图2.3）。图3展示了一个经过验证为源自单个细胞的群体，该验证是通过喷嘴影像及第0天的3D全孔成像完成。展示了细胞在底部沉淀后的状态，以及在分配事件后的第1天、第4天和第7天所拍摄的后续影像。整个成像过程快速且高效，仅需约3分钟即可处理一个384孔的板，从而实现后续的高通量群体追踪。
图2.UP.SIGHT 2.0对于每个孔的工作流程
1）通过喷嘴成像可以验证分配的液滴中仅包含单个细胞，2）对分配后的孔进行一系列3D全孔成像，以做第二次验证，3）对随时间生长的菌落进行成像以确保克隆性的一致性。
图3.UP.SIGHT在菌落生长追踪中的应用，分别为第0、1、4和7天的菌落成像。
2. 喷嘴图像与3D全孔成像相结合，为单克隆性细胞分配提供了多重保证
喷嘴图像与3D全孔成像的结合进一步验证了细胞在孔板中的分布情况。与有限稀释法或流式细胞术等传统方法相比，UP.SIGHT 2.0在单细胞分配过程中提供了更可靠的验证，单细胞分配效率超过98%。然而，算法在某些情况下可能会误判为仅分配了一个细胞，而实际上可能是两个相互粘连的细胞。因此，引入3D全孔成像为单细胞分配的确认提供了第二种方法，以确保仅有一个细胞被分配。
图4展示了两个喷嘴图像及其相应的3D全孔成像示例。在这些示例中，红色和绿色CHO细胞被混合并分配，所形成的菌落也被荧光成像仪捕捉到。在图4.1中，喷嘴图像清晰显示仅选择了一个细胞，3D全孔成像显示的单个细胞和单色菌落进一步验证了这一点，证实这是一个单克隆细胞系。而在图4.2中，仅凭喷嘴图像难以确认是否仅选择了一个细胞，而3D全孔成像则清楚地证实分配了两个细胞，并且这两个细胞分别生成了红色和绿色的菌落。在这个例子中，喷嘴图像与3D全孔成像的结合帮助判定这是一个非克隆的细胞群体，并将其排除在进一步分析之外。
图4.UP.SIGHT通过喷嘴和3D全孔成像为克隆性提供多种保证
3. 实现>99.99%的单克隆概率
为确定UP.SIGHT 2.0实现单克隆性的概率，我们计算了喷嘴图像和3D全孔成像相关的误差率。本研究采用红色和绿色1:1混合的CHO细胞，评估单细胞分配和3D全孔成像的错误率。
根据喷嘴图像将4000多个细胞分配到孔板中，以确定喷嘴图像的误差率。验证孔板中的细胞后发现，41个孔实际上包含两个细胞，因此可以确认喷嘴图像的误差率为1.0%。
对于3D全孔成像的误差率，我们保留了一部分孔板用于菌落评估，并将3D全孔图像中标记为单个细胞的孔与实际获得的菌落进行比较。红色和绿色细胞均被沉积，因此任何含有多色菌落的孔都表明存在3D全孔成像误差。经过评估，1800多个孔中得出了991个菌落，其中有2个混合颜色的菌落被错误分类。由此，3D全孔成像的误差率估计为0.7%。将这两个误差率相乘，得出UP.SIGHT 2.0提供的单克隆性概率超过99.99%。尽管在3D全孔图像中无法将两个混合颜色的菌落识别为非克隆菌落，但在相应的喷嘴图像中，这两个孔均能被识别为非克隆。
4. 部分3D全孔成像不仅提供了>99.99%的单克隆性概率，还显著提升了成像速度
在3D全孔成像过程中，细胞聚焦的图像堆叠位置在各孔板之间保持一致。此过程中共获取了81张图像，以全面覆盖孔体积。对1500多个孔的评估显示，细胞的平均位置位于图像堆叠的第65层（图像1为孔底，图像81为液体顶部），其标准偏差为4.2，最小值为第45张图像。这些变化主要源于孔底高度的不一致及移液过程中的误差。由于细胞沉降速度较慢，细胞在分配后不太可能立即位于孔板的下部。因此，可以省略对孔底的成像，从中间层开始拍摄至液体顶部，从而有效减少处理时间，同时保持较高的单克隆性概率。表2展示了384孔板示例中每个孔的细胞聚焦图像堆叠位置。尽管捕获了81张图像，但从液体体积中心开始的40幅图像已足以捕捉所有细胞，并实现与3D全孔成像相同的单克隆性概率。表3对不同工作流程进行了比较，展示了各自的处理时间和单克隆性概率。 
表2.在3D全孔成像中，从液体体积中心成像仍然可以捕获细胞，并保持高概率的单克隆性。81张图像覆盖整个体积，细胞通常在图像55至70间可见。由于细胞沉降缓慢，仅需从中心开始的40张图像，无需评估孔的下半部分。
表3.工作流程处理时间的比较
实验结论
UP.SIGHT 2.0是一种多功能设备，具备单细胞的分离、验证与菌落生长监测能力。其创新的3D全孔成像技术为每个孔提供全面的液体体积成像，完全不依赖离心孔板进行单细胞分配验证，这一创新显著提升了实验的灵活性和准确性。
通过对单细胞的成像与记录，UP.SIGHT 2.0为克隆性验证提供了可靠的双重保障。以上研究对超过4000个单细胞进行了深入验证，结果显示该工作流程实现了超过99.99%的单克隆率。此外，部分3D全孔成像结果显示，单克隆性的概率也超过99.99%，并且成像速度显著提高，这进一步增强了实验效率和可靠性。
总之，UP.SIGHT 2.0不仅提升了单细胞研究的准确性和效率，还为未来的细胞生物学研究提供了强有力的工具支持。这一技术的出现，将推动细胞研究领域的发展，为深入理解细胞行为与特性奠定基础。
UP.SIGHT 2.0 （影像式单细胞打印与成像系统）通过双重验证机制有效解决了细胞分配中的挑战。该系统的第一次验证是通过一系列喷嘴图像记录单细胞的分离情况，第二次验证则采用3D全孔成像技术直接捕获液体体积的图像。这种3D成像技术能够完整捕捉液体体积，从而避免了克隆后所需的离心操作。此外，UP.SIGHT 2.0还支持菌落生长后的实时监测，兼容96、384和1536孔板，适用于高通量工作流程，且单细胞分配效率超过98%。
图1. UP.SIGHT 2.0
本研究分析了4000个单细胞和近1000个生长的菌落，结果表明：结合喷嘴图像与3D全孔成像，细胞株的单克隆性概率超过99.99%，且无需依赖荧光染色或成像技术。
结果展示
1. 在一个设备中提供单细胞分配、孔内验证和菌落跟踪功能
UP.SIGHT 2.0为克隆、克隆验证和追踪提供了一个完整的工作流程（图2）。流程的第一步是将细胞悬浮液加载到设备中的一次性墨盒中。在单细胞分配过程中，喷嘴会生成微型自由飞行液滴，并持续进行成像（图2.1）。图像处理算法实时评估即将到来的液滴，判断其是否包含0、1或多个细胞。如果液滴被判定为包含0、多个细胞，或尽管只含一个细胞但其特征（如大小、圆度或荧光强度）不符合预设标准，该液滴将被丢弃。相反，若检测到1个单细胞，且该细胞的大小、圆度和荧光强度等均符合标准，则该细胞将被分配至孔板中。针对每个成功分配的单细胞，系统会生成五张图像，以确认单细胞的分离与排出情况。分配完成后，使用孔板下方的第二台相机进行 3D 全孔成像，捕获孔中的一系列图像（图2.2），这一成像设备为目标孔中分配的单细胞提供了二次确认。
3D全孔成像捕获的图像数量取决于板的类型和孔中介质的体积，这种成像方式消除了对孔板进行离心的需求。由于成像是细胞在介质中沉降时进行的，而细胞通常位于液体体积的上半部分，因此与仅在孔底进行第0天成像相比，这种方式大大减少了由于板或边缘效应造成的畸变影响，从而提升了细胞检测的准确性。
在克隆后的阶段，UP.SIGHT 2.0能够对具有理想生长曲线的特定克隆进行成像并追踪其群体生长（图2.3）。图3展示了一个经过验证为源自单个细胞的群体，该验证是通过喷嘴影像及第0天的3D全孔成像完成。展示了细胞在底部沉淀后的状态，以及在分配事件后的第1天、第4天和第7天所拍摄的后续影像。整个成像过程快速且高效，仅需约3分钟即可处理一个384孔的板，从而实现后续的高通量群体追踪。
图2.UP.SIGHT 2.0对于每个孔的工作流程
图3.UP.SIGHT在菌落生长追踪中的应用，分别为第0、1、4和7天的菌落成像。
2. 喷嘴图像与3D全孔成像相结合，为单克隆性细胞分配提供了多重保证
喷嘴图像与3D全孔成像的结合进一步验证了细胞在孔板中的分布情况。与有限稀释法或流式细胞术等传统方法相比，UP.SIGHT 2.0在单细胞分配过程中提供了更可靠的验证，单细胞分配效率超过98%。然而，算法在某些情况下可能会误判为仅分配了一个细胞，而实际上可能是两个相互粘连的细胞。因此，引入3D全孔成像为单细胞分配的确认提供了第二种方法，以确保仅有一个细胞被分配。
图4展示了两个喷嘴图像及其相应的3D全孔成像示例。在这些示例中，红色和绿色CHO细胞被混合并分配，所形成的菌落也被荧光成像仪捕捉到。在图4.1中，喷嘴图像清晰显示仅选择了一个细胞，3D全孔成像显示的单个细胞和单色菌落进一步验证了这一点，证实这是一个单克隆细胞系。而在图4.2中，仅凭喷嘴图像难以确认是否仅选择了一个细胞，而3D全孔成像则清楚地证实分配了两个细胞，并且这两个细胞分别生成了红色和绿色的菌落。在这个例子中，喷嘴图像与3D全孔成像的结合帮助判定这是一个非克隆的细胞群体，并将其排除在进一步分析之外。
图4.UP.SIGHT通过喷嘴和3D全孔成像为克隆性提供多种保证
3. 实现>99.99%的单克隆概率
为确定UP.SIGHT 2.0实现单克隆性的概率，我们计算了喷嘴图像和3D全孔成像相关的误差率。本研究采用红色和绿色1:1混合的CHO细胞，评估单细胞分配和3D全孔成像的错误率。
根据喷嘴图像将4000多个细胞分配到孔板中，以确定喷嘴图像的误差率。验证孔板中的细胞后发现，41个孔实际上包含两个细胞，因此可以确认喷嘴图像的误差率为1.0%。
对于3D全孔成像的误差率，我们保留了一部分孔板用于菌落评估，并将3D全孔图像中标记为单个细胞的孔与实际获得的菌落进行比较。红色和绿色细胞均被沉积，因此任何含有多色菌落的孔都表明存在3D全孔成像误差。经过评估，1800多个孔中得出了991个菌落，其中有2个混合颜色的菌落被错误分类。由此，3D全孔成像的误差率估计为0.7%。将这两个误差率相乘，得出UP.SIGHT 2.0提供的单克隆性概率超过99.99%。尽管在3D全孔图像中无法将两个混合颜色的菌落识别为非克隆菌落，但在相应的喷嘴图像中，这两个孔均能被识别为非克隆。
4. 部分3D全孔成像不仅提供了>99.99%的单克隆性概率，还显著提升了成像速度
在3D全孔成像过程中，细胞聚焦的图像堆叠位置在各孔板之间保持一致。此过程中共获取了81张图像，以全面覆盖孔体积。对1500多个孔的评估显示，细胞的平均位置位于图像堆叠的第65层（图像1为孔底，图像81为液体顶部），其标准偏差为4.2，最小值为第45张图像。这些变化主要源于孔底高度的不一致及移液过程中的误差。由于细胞沉降速度较慢，细胞在分配后不太可能立即位于孔板的下部。因此，可以省略对孔底的成像，从中间层开始拍摄至液体顶部，从而有效减少处理时间，同时保持较高的单克隆性概率。表2展示了384孔板示例中每个孔的细胞聚焦图像堆叠位置。尽管捕获了81张图像，但从液体体积中心开始的40幅图像已足以捕捉所有细胞，并实现与3D全孔成像相同的单克隆性概率。表3对不同工作流程进行了比较，展示了各自的处理时间和单克隆性概率。
表2.在3D全孔成像中，从液体体积中心成像仍然可以捕获细胞，并保持高概率的单克隆性。81张图像覆盖整个体积，细胞通常在图像55至70间可见。由于细胞沉降缓慢，仅需从中心开始的40张图像，无需评估孔的下半部分。
表3.工作流程处理时间的比较
实验结论
UP.SIGHT 2.0是一种多功能设备，具备单细胞的分离、验证与菌落生长监测能力。其创新的3D全孔成像技术为每个孔提供全面的液体体积成像，完全不依赖离心孔板进行单细胞分配验证，这一创新显著提升了实验的灵活性和准确性。
通过对单细胞的成像与记录，UP.SIGHT 2.0为克隆性验证提供了可靠的双重保障。以上研究对超过4000个单细胞进行了深入验证，结果显示该工作流程实现了超过99.99%的单克隆率。此外，部分3D全孔成像结果显示，单克隆性的概率也超过99.99%，并且成像速度显著提高，这进一步增强了实验效率和可靠性。
总之，UP.SIGHT 2.0不仅提升了单细胞研究的准确性和效率，还为未来的细胞生物学研究提供了强有力的工具支持。这一技术的出现，将推动细胞研究领域的发展，为深入理解细胞行为与特性奠定基础。
