熔解曲线的介绍及熔解曲线问题分析
熔解曲线介绍
熔解曲线是通过评估双链DNA的温度依赖性解离来确定检测的特异性。当使用嵌合荧光染料（如SYBR Green或EVA Green）时，运行熔解曲线可确定在qPCR反应中是否扩增出单一产物。
典型的熔解曲线步骤，通常从60℃增加到95℃使反应样品缓慢变性，同时每0.1-0.5℃逐步收集荧光。随着温度的逐渐升高，双链DNA会逐渐解链成单链，嵌入到双链DNA小沟上的荧光染料分子也会逐渐脱落下来，荧光强度随之逐渐下降。荧光强度的累积数据点与温度的关系曲线就是熔解曲线的原始图谱。在到达某个温度时，DNA双链解开一半，且荧光强度骤然下降，该温度即称为熔解温度（Tm）。当扩增子达到Tm时，荧光强度会突然下降，这与扩增子长度和GC含量有关。
qPCR软件通常会显示熔解曲线的一阶导数图谱，使得熔解曲线在给定扩增子的特定熔解温度（Tm）处产生峰值，用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物（如引物二聚体）区分开，因为它们在不同的温度熔解。所以，熔解曲线中出现多个或移动的峰值可能反映引物特异性、DNA交叉污染、引物二聚体或基因组DNA污染等相关问题。
图1：熔解曲线分析。A)：通过熔解曲线分析来确定PCR产物的熔解温度（Tm）。B)：单峰是必要的，以确保只有一个给定产物被引物对扩增。产生次级产物或引物二聚体会改变qPCR的效率，影响结果的准确性、精密度和可重复性。
当一些双链非特异性产物在反应中扩增时，嵌合荧光染料会与它们结合，导致qPCR反应的荧光强度增加，使反应效率提高到100%以上。这会导致Cq值低于预期，目标DNA的估计值过高，进而影响数据和结论的准确性。因此，在未知样品、无模板对照（NTC）、无反转录酶对照（NRT），以及阳性和阴性对照样品上运行熔解曲线是至关重要的，以确保检测到单峰。
熔解曲线问题分析
前峰、偏峰或多峰都是反应中积累非特异性产物的强烈信号，在进行模板定量分析之前需要进一步排查问题（图2）。
在进行熔解曲线分析时，重要的是在第一次使用时验证所有引物对，通过在琼脂糖凝胶上运行最终的PCR产物，以确保观察到的熔解峰与预期的目标产物大小相对应。虽然熔解曲线/峰是特异性的强指标，但需要注意的是，一些长度和序列相似的靶标可能具有相同的熔解曲线。此外，不同样品中存在的不同试剂、不同的离子强度和随机污染物可能会导致观察到的熔解峰发生偏移，即使所需的靶标已被高特异性扩增（图3）。
当反应中积累多种产物时，也会观察到异常的熔解峰，例如脱靶引物形成的多个产物、引物二聚体或引物发夹形成的多个产物。反应中的多种产物会产生相应数量的、通常不同的熔解峰，每个峰都集中在不同的温度上（图3）。在某些情况下，多个产物会出现双峰或前峰。引物二聚体或发夹通常会在比全长引物更低的温度下出现。
有时，某些扩增子即使没有其他产物，也会产生双峰。当扩增子序列中不同区域的GC含量差异很大时，就会出现这种情况。这种碱基对含量的不均匀会导致低GC区域先发生部分变性，然后富含GC的区域在较高温度下发生变性，最终出现两个不同的峰值。哺乳动物CFTR基因就是一个明显的例子。虽然这种现象很少见，但在进行qPCR分析时仍需注意。
QX系列实时荧光定量PCR系统
QX系列实时荧光定量PCR系统，采用先进的双PID算法和温控技术，结合免维护光学系统和灵活的连接操控方式。这不仅提供了更快的升降温速度，同时还带来了更好的温控精准度和均一性，以确保您实验数据的准确性和可靠性。配合业界领先的荧光定量PCR数据处理软件，QX系列将荧光信号处理、专业的数据计算方法、严谨的统计学分析功能整合为一站式解决方案，从核酸到蛋白研究，满足探索各种科学问题的实验需要，重新定义了科研级荧光定量PCR系统。
熔解曲线是通过评估双链DNA的温度依赖性解离来确定检测的特异性。当使用嵌合荧光染料（如SYBR Green或EVA Green）时，运行熔解曲线可确定在qPCR反应中是否扩增出单一产物。
典型的熔解曲线步骤，通常从60℃增加到95℃使反应样品缓慢变性，同时每0.1-0.5℃逐步收集荧光。随着温度的逐渐升高，双链DNA会逐渐解链成单链，嵌入到双链DNA小沟上的荧光染料分子也会逐渐脱落下来，荧光强度随之逐渐下降。荧光强度的累积数据点与温度的关系曲线就是熔解曲线的原始图谱。在到达某个温度时，DNA双链解开一半，且荧光强度骤然下降，该温度即称为熔解温度（Tm）。当扩增子达到Tm时，荧光强度会突然下降，这与扩增子长度和GC含量有关。
qPCR软件通常会显示熔解曲线的一阶导数图谱，使得熔解曲线在给定扩增子的特定熔解温度（Tm）处产生峰值，用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物（如引物二聚体）区分开，因为它们在不同的温度熔解。所以，熔解曲线中出现多个或移动的峰值可能反映引物特异性、DNA交叉污染、引物二聚体或基因组DNA污染等相关问题。
当一些双链非特异性产物在反应中扩增时，嵌合荧光染料会与它们结合，导致qPCR反应的荧光强度增加，使反应效率提高到100%以上。这会导致Cq值低于预期，目标DNA的估计值过高，进而影响数据和结论的准确性。因此，在未知样品、无模板对照（NTC）、无反转录酶对照（NRT），以及阳性和阴性对照样品上运行熔解曲线是至关重要的，以确保检测到单峰。
熔解曲线问题分析
前峰、偏峰或多峰都是反应中积累非特异性产物的强烈信号，在进行模板定量分析之前需要进一步排查问题（图2）。
图2：尾峰和前峰的例子，表明有引物二聚体的存在。
在进行熔解曲线分析时，重要的是在第一次使用时验证所有引物对，通过在琼脂糖凝胶上运行最终的PCR产物，以确保观察到的熔解峰与预期的目标产物大小相对应。虽然熔解曲线/峰是特异性的强指标，但需要注意的是，一些长度和序列相似的靶标可能具有相同的熔解曲线。此外，不同样品中存在的不同试剂、不同的离子强度和随机污染物可能会导致观察到的熔解峰发生偏移，即使所需的靶标已被高特异性扩增（图3）。
图3：偏移或双峰的例子，表明非特异性产物扩增。
当反应中积累多种产物时，也会观察到异常的熔解峰，例如脱靶引物形成的多个产物、引物二聚体或引物发夹形成的多个产物。反应中的多种产物会产生相应数量的、通常不同的熔解峰，每个峰都集中在不同的温度上（图3）。在某些情况下，多个产物会出现双峰或前峰。引物二聚体或发夹通常会在比全长引物更低的温度下出现。
有时，某些扩增子即使没有其他产物，也会产生双峰。当扩增子序列中不同区域的GC含量差异很大时，就会出现这种情况。这种碱基对含量的不均匀会导致低GC区域先发生部分变性，然后富含GC的区域在较高温度下发生变性，最终出现两个不同的峰值。哺乳动物CFTR基因就是一个明显的例子。虽然这种现象很少见，但在进行qPCR分析时仍需注意。
QX系列实时荧光定量PCR系统
QX系列实时荧光定量PCR系统，采用先进的双PID算法和温控技术，结合免维护光学系统和灵活的连接操控方式。这不仅提供了更快的升降温速度，同时还带来了更好的温控精准度和均一性，以确保您实验数据的准确性和可靠性。配合业界领先的荧光定量PCR数据处理软件，QX系列将荧光信号处理、专业的数据计算方法、严谨的统计学分析功能整合为一站式解决方案，从核酸到蛋白研究，满足探索各种科学问题的实验需要，重新定义了科研级荧光定量PCR系统。
基于JLM qPCR平台的熔解曲线分析
