CERO 3D细胞类器官培养系统的应用：探索纳米颗粒长期细胞影响

随着纳米技术的发展，纳米颗粒（NPs）已广泛应用于多个领域，但其对人体健康的长期影响仍不明确。近期研究利用CERO 3D细胞类器官培养系统等创新技术，深入探究了纳米颗粒对细胞的长期影响。

研究背景与意义
传统细胞毒性测试多关注短期暴露，难以评估纳米颗粒长期接触细胞的潜在风险。CERO 3D系统为研究提供了新工具，有助于理解纳米颗粒与细胞的相互作用，为纳米材料的安全应用提供理论支持。

实验方法和结果
细胞毒性测定
研究选择了EAhy 926内皮细胞和THP-1单核细胞，使用CASY系统精确控制细胞数量。内皮细胞采用CERO 3D培养和传统传代培养，单核细胞在CELLine CL350生物反应器中培养（图1）。实验选用了多种纳米颗粒，通过先进技术全面表征其物理化学性质，并使用荧光标记的纳米颗粒精确测定细胞摄取率。细胞毒性测定采用CellTiter 96® AQueous非放射性细胞增殖测定法（基于甲臜生物还原原理），能够精准评估纳米颗粒对细胞增殖的影响。
 

图1：暴露方案：A：在台式生物反应器BioLevitator中微珠上培养细胞。B：在CELLine 350烧瓶生物反应器中培养细胞。C：当对照细胞达到融合度时将所有细胞转移到更大的培养容器中（C1），或者在新的相同大小的培养容器中以1:10的比例收获并传代细胞（C2）。

选择暴露系统对细胞毒性测试结果至关重要，不是所有系统都同样有效。CELLine CL350系统不适合评估THP-1细胞的慢性细胞毒性，因为它对细胞密度敏感。在细胞毒性测试中，需要避免高细胞密度以防止生长抑制。在CELLine CL350系统中，只有低细胞密度条件下才能进行长达16天的观察，但细胞生长不可重复。传代实验中，直接转移所有细胞的方法（图1C1）比每周1:10传代的方法更可靠（图1C2）。长期细胞毒性的浓度通常是急性细胞毒性浓度的一半，不同纳米颗粒的长期和短期暴露毒性浓度差异显著。

针对不同细胞类型和培养系统，研究人员精心设置了合理的暴露浓度范围，如聚苯乙烯颗粒为12.5 - 25 - 50 μg/ml，二氧化硅颗粒为25 - 50 - 100 μg/ml，SCNTs为5 - 10 - 20 μg/ml。同时，确定了不同培养条件下的最长评估时间，在CERO 3D 细胞类器官培养系统中培养的EAhy926 细胞最长评估时间可达28天，在CELLine CL350 中培养的THP - 1细胞为16天，传代培养的EAhy926细胞和THP - 1细胞为16天，为全面评估纳米颗粒的短期和长期细胞毒性提供了可靠依据。

纳米颗粒性质变化与细胞摄取
结果显示，纳米颗粒在培养基中行为复杂，团聚现象明显，部分积累在细胞溶酶体中。细胞对纳米颗粒的摄取率因类型而异，摄取率与细胞毒性之间无简单线性关系。

图2：EAhy926细胞在暴露于红色荧光标记的纳米颗粒PPS20（A）、SiO2（B）和SCNTc（C）24小时后的摄取情况。颗粒（红色）与溶酶体（通过绿色荧光活性染料LysoTracker识别）在不同程度上共定位。共定位显示为黄色。比例尺：20微米。

所有纳米颗粒均出现了不同程度的团聚，羧基化单壁碳纳米管迅速聚集成束，单管比例微乎其微；聚苯乙烯颗粒和二氧化硅颗粒的尺寸在培养基中显著增大。与此同时，纳米颗粒部分积累在细胞溶酶体中，细胞对纳米颗粒的摄取率因细胞类型而异，EAhy926 细胞摄取率约为2%，THP-1细胞约为7%。

研究微载体培养中纳米颗粒的作用模式与长期效应
CERO的这个载体培养系统（70小时）比常规培养（30小时）更有效。EAhy 926细胞在GEM™表面上增殖，并通过Hoechst 33342、线粒体和内质网活性染色显示细胞活力，同时红色荧光PPS主要在溶酶体中定位。
 

图3：在优化微载体培养系统中加入无毒浓度的20 nm和200 nm PPS及MWCNT纳米颗粒，每周更新培养基。采用Hoechst 33342染色观察细胞附着（3 A），用ER-Tracker green和MitoTracker DeepRed 633标记细胞器评估细胞活力(3 B)，并用红色荧光PPS追踪纳米颗粒定位（主要至溶酶体）(3 C)。每周通过ApoTox-Glo Triplex Assay评估细胞活力、毒性和凋亡情况，7天后行Western blot分析PARP-1以区分凋亡与坏死，深入探究纳米颗粒在微载体培养中的作用及长期影响机制。

EAhy 926细胞附着在GEM™上。用Hoechst 33342染料染色显示了在GEM™上的细胞增殖增加（图3 A）。此外，对线粒体和内质网（ER）的活性染色证明了细胞的活力（图3 B）。细胞内PPS的定位：细胞暴露于20 mg/ml的红色荧光PPS以研究细胞定位。在细胞内观察到R25，主要定位在溶酶体中（图3 C）。

CERO系统的优势
CERO 3D细胞类器官培养系统在细胞毒性检测中具有显著优势，其3D培养技术模拟体内环境，自动化操作简化了实验流程，同时高精度监测与控制功能、低剪切力设计和高效气体传递能力共同为细胞提供了适宜的生长环境，维持了细胞的完整性和生理功能。此外，系统的可扩展性为从实验室规模到大规模药物研发生产的不同规模研究提供了便利，提高了实验效率和可重复性，是研究纳米颗粒长期影响的理想模型。

展望
研究结果表明，长期暴露于纳米颗粒对细胞有显著影响，检测细胞毒性的浓度与暴露模型紧密相关，为安全应用奠定理论基础并指明研究方向。未来，优化CERO系统培养条件，深入探究纳米-细胞器互作，开发更灵敏检测法，将全面理解纳米颗粒对细胞的影响。CERO等技术助力纳米技术在医疗、食品等领域发挥更大潜力，造福人类健康与社会发展。