PIPETTY电动移液器在酶联免疫吸附（ELISA）实验中的应用

一、实验准备：
1、pipetty电动移液器MSIC01-02-1000
2、待检测的细胞培养上清液或细胞沉淀，
3、Elisa试剂盒
4、酶标仪
5、37摄氏度烘箱
6、离心管、96孔板等

二、实验步骤：
1、试剂准备
①细胞培养上清液配制：用无菌管收集细胞培养上清液，2000-3000rpm离心20分钟，仔细收集上清液
②洗涤液配制：蒸馏水1:20稀释。
③标准品配制：取7个1.5ml离心管，分别标注S2,S3,S5,S6,S7,blank，分别加入样品稀释液/标准品对冲，标准曲线浓度分别为4000，2000，1000，500，250，125，6.25，0。
④生化素抗体工作液配制：使用前20分钟稀释100倍
⑤SABC复合物工作液配制：使用前20分钟稀释100倍
⑥TMB显色液配制：使用前10分钟，A:B 1:1混合，避光保存。

2、检测程序

①加样：空白孔用pipetty移液器加入50ul标准品/样品稀释液，其余孔加入标准品/待测样品50ul，贴上封板胶，37摄氏度，40分钟放置。
②洗板：每一个孔加入300ul洗涤液震荡浸泡2分钟，滤纸印干。
③加抗体：空白孔加入100ul生物素化抗体稀释液，其余孔各加入 1x的生物素化抗体工作液100ul，贴上封板胶。
④洗板：同上。
⑤加SABC:空白孔加入 100ul SABC 稀释液，其余孔各加SABC 复合物工作液 100ul，贴上封板胶纸，混匀后置37摄氏度，30分钟。
⑥洗板：同上。
⑦显色：每孔加入提前配置好的TMB 混合液 100ul，贴上封板胶纸，混匀后置37°C暗处反应 10-20分钟 （具体显色时间根据显色结果而定）。
⑧将pipetty移液器调到混匀模式，混匀，然后每孔加入 100ul 终止液，30 分钟内用酶标仪 在450nm 处测吸光值。

3、结果判断与计算
以标准品浓度作横坐标，OD 值作纵坐标，手工绘制或用软件绘制标准曲线，根据样品 OD值计算出相应含量，再乘以稀释倍数即可。
 
小tips在这：
1.显色底物现配现用，避免污染，还有前面需要配制的试剂也是如此.
2.使用前检查底物在加入96孔板之前应为无色透明，这个非常重要.
3.孵育时间，按说明书条件来，显色需要根据颜色变化来判断是否可以终止反应.