小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1培养及经典“鸡尾酒”诱导攻略

流行性肥胖是近几年的一大健康挑战，肥胖促使一些心血管疾病如高血压、血栓等发病率增高，糖尿病则是以高血糖为特征的代谢性疾病，长期存在可导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。3T3-L1细胞——小鼠胚胎成纤维细胞（前脂肪细胞）系具有向脂肪细胞分化的特性，被广泛用于研究糖尿病，肥胖症等。
 

图1 3T3-L1细胞形态

表1 3T3-L1基础培养信息

培养小提示：

1）"Never allow culture to become completely confluent”。细胞汇合度达到70-80%时进行传代；
2）为了避免细胞聚团，在等待细胞消化的过程中，不要通过击打或摇晃瓶子来刺激细胞。难以消化的细胞可以放置在37℃；
3）正常培养（非脂肪诱导期）出现空泡时，请优先考虑环境压力。造成压力的原因包括培养基中缺乏谷氨酰胺、添加抗真菌药物、培养基中二氧化碳、碳酸氢钠浓度不当或培养基的营养物质耗尽；
4）使用胎牛血清可能会造成细胞分化！！！

3T3-L1成脂诱导“鸡尾酒”策略

图2 3T3-L1细胞（正常）和3T3-L1成脂分化后（对照）

一般认为，细胞的增值和分化呈负相关，细胞开启分化必先退出分裂增值周期，常用的方法就是让其生长至融合期，出现接触抑制。脂肪生成是一个将碳水化合物和其他底物转化为脂肪酸，然后作为TAGs（甘油三酯）储存起来的过程。

经典“鸡尾酒”法中，胰岛素样生长因子(IGF-1)激活有丝分裂原蛋白激酶途径诱导细胞分化、cAMP磷酸二酯酶抑制剂(IBMX)通过激活cAMP依赖性蛋白激酶途径增强CCAAT/增强子结合蛋白家族(C/EBPs)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ) 表达促进成脂分化、地塞米松促进C/EBPs的表达。

3T3-L1经典成脂诱导过程

诱导步骤：将融合后的3T3-L1（汇合度100%）细胞从DMEM生长培养基切换到含有0.5mmol/L IBMX(abs817348)、10mg/mL胰岛素和1μmol/L地塞米松的分化培养基中48h。然后将细胞维持在含有10%FBS和10 mg/mL胰岛素的DMEM培养基中48h，之后每隔一天更换常规新鲜培养基，一般第九天染色。

PS：不同产品活性纯度不同，浓度仅供参考，不同诱导方案略有差异，IBMX(abs817348)用DMSO溶解时需要超声破碎。

染色：油红O储存液与超纯水按3:2稀释混匀，过滤，避光静置后酒红色且无沉淀，现配现用，2h内用完。

用PBS磷酸缓冲液小心漂洗细胞三次，以2mL/孔（六孔板）的剂量加入4%多聚甲醛，室温固定40min，再用蒸馏水漂洗2次，每孔加入油红O工作液1mL，常温染色15min，蒸馏水漂洗至无残渣，蒸馏水漂洗后加入PBS镜下观察。

PS：清洗细胞时动摇要轻柔，防止脂滴脱落，油红O工作液一定要过滤至无沉淀，否则染色后有残渣且较难冲洗！！！

“鸡尾酒”诱导策略进击版

有研究者探索了葡萄糖浓度和诱导液2（含10mg/mL胰岛素的低糖培养基）的作用时间对3T3L1细胞成脂分化率的影响，结果显示，低糖培养基诱导时成熟脂肪细胞形成率明显增高，诱导液2作用时间为3d时，成熟脂肪细胞形成率明显高于其他组。

图3 不同葡萄糖浓度对3T3-L1细胞成脂肪分化的影响
Figure2 Results of different time points during adipogenic differentiation of 3T3-L1 cells

图4 诱导剂II作用时间对3T3-L1细胞成脂肪分化的影响

图5 3T3-L1细胞成脂肪分化过程中不同时间点结果记录（最优条件下）

注：文中图片来源于网络，仅供学习参考用