迎难而上，类器官的血管化研究的破茧之路

类器官(Organoids)是将具有干性潜能的细胞在体外进行3D培养，形成多种特异性细胞类型集合的微器官团，能够体外再现真实器官的三维构造及生理功能。然而体外培养的类器官往往缺乏有效的血管，随着类器官体积的增加，缺氧及代谢废物累积导致细胞凋亡，最终致使组织坏死，因此目前培养的类器官无论是形态大小还是生理功能都无法做到完全模拟真实的组织器官，这也是类器官培养技术发展的重大瓶颈之一。类器官的血管化研究一直是类器官研究领域的热点与难点。本文中，我们整理了近年来科学家们在类器官血管化研究领域的进展，分享给大家。

01 脑类器官血管化研究

有研究表明中枢神经系统在发育过程中不会产生血管祖细胞[1]，血管祖细胞的缺乏则阻碍了类器官的血管化进程。为了培养血管化的脑类器官，2018年Pham MT等[2]将同一患者来源的人诱导多能干细胞(iPSCs)衍生的血管内皮细胞(ECs)与脑类器官共培养，移植入免疫缺陷的小鼠脑内。移植当天免疫荧光检测结果显示CD31阳性细胞围绕在类器官周围，移植后随着脑类器官在体内的进一步发育成熟，切片染色结果显示新形成的人毛细血管强有力的向脑类器官干细胞核心区渗透，核心区外围则显示出典型的连续性内生化血管网络结构。未血管化的脑类器官在移植后则无法存活，然而该研究尚未涉及移植物类器官血管与宿主血管之间的相互作用。

脑类器官染色图，白色箭头为新生血管[2] hCD31为血管细胞标志物；STEM121为人脑干细胞标志物；DAPI为细胞核染料。

2018年Mansour AA等[3]在体外将人胚胎干细胞(hESC)诱导分化为小型脑类器官后，直接移植入免疫缺陷小鼠软脑膜血管上。移植的类器官继续进行神经分化和成熟并与小鼠脑组织进行了很好的整合，双光子扫描成像结果显示小鼠血管侵入移植物并生长延伸，血管内血流活跃，移植物类器官功能性血管网络发展良好。

人类ETS变体2(ETV2)转录因子与人血管内皮细胞的形成高度相关。2019年Cakir B等[4]设计了一种表达人类ETV2转录因子的hESCs细胞，诱导该细胞分化成为带血管蒂的人皮层脑类器官(vhCOs)。体外培养的vhCOs体积、神经细胞存活率均显著大于对照组。在vhCOs中部分特殊的内皮细胞还形成了神经周血管丛，并与脑内的神经血管紧密相连，十分类似于血脑屏障结构。将该vhCOs移植入免疫缺陷的小鼠腿内，FITC灌注结果显示ETV2诱导的内皮细胞支持功能性的血管系统形成。
2020年Shi Y等[5]则是将hESCs或iPSCs与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养，定向诱导其分化为血管化的脑类器官。免疫荧光染色结果表明，HUVECs在脑类器官中相互连接，并形成具有通透能力的复杂血管系统，该血管系统可以在脑类器官中可稳定存在200天以上。研究者将血管化脑类器官植入免疫缺陷小鼠脑内S1皮质空洞中，免疫荧光检测结果显示在脑类器官移植物中HUVECs 与宿主小鼠血管内皮细胞发生了整合，并在脑类器官中形成了有血液流动的功能性血管网络系统，支持其成熟存活。

02 肝类器官血管化研究

2011年Baptista PM等[6]使用灌注洗涤剂去除肝脏组织的细胞成分，同时保留了完整的的血管网络。将hUVECs和人胎肝细胞(hFLCs)接种到脱细胞支架中，利用肝脏内部血管网络包括大血管及微血管网络结构，实现肝脏组织的血管化培养。

肝脏脱细胞后血管脉络图[6]

hPSC来源的小肠类器官(vHIO)及对照组染色图[8] ECAD为蛋白染色；CD144为EC细胞标志物。

04肾脏类器官血管化研究

2019年Low JH等[9]通过动态调节WNT信号通路，控制近端肾小球和远端肾小管的比例，调节近端足细胞释放血管内皮生长因子A(VEGFA)的水平，进而诱导血管化的肾脏类器官分化形成。免疫荧光检测结果明确了肾脏发育的起始阶段存在内源性血管内皮祖细胞，血管内皮祖细胞的发育依赖于足细胞分泌的VEGFA，并且VEGFA的分泌量决定了血管网络的丰度。血管化的肾脏类器官移植入宿主小鼠后，继续发育成肾小球毛细血管簇，右旋糖酐灌注实验结果显示与野生型小鼠肾脏类似，移植的肾脏类器官具有初步的过滤和重吸收功能。

第24天，肾类器官免疫荧光染色图[9] CD34为ECs表面标志物; CD31为ECs表面标志物; NPHS为肾足突细胞标志物; DAPI为细胞核染料。